應用TaqMan熒光定量RT-PCR方法檢測PRRSV變異株在萊蕪黑豬體內動態(tài)分布

王 輝，李井新，孫 振，謝之景，姜運良，成子強，周恩民，姜世金

（山東農業(yè)大學動物醫(yī)學院，泰安271018；2.山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室，泰安271018；3.西北農林科技大學動物醫(yī)學院，楊凌 712100）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Procine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）屬于套式病毒目、動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬成員，為單股正鏈RNA 病毒，主要引起母豬的繁殖障礙，如流產、早產、死胎、木乃伊胎和呼吸道癥狀等，稱為豬繁殖與呼吸綜合征（procine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）[1]。PRRSV主要分為歐洲型和美洲型，1996年在國內首次分離到PRRSV，目前在我國流行的PRRSV 主要為美洲型[2]。2006年，無名高熱病在我國南方流行，最終確定為PRRSV高致病性nsp2變異株[3]。目前, 常用的診斷方法有RTPCR、間接免疫熒光試驗、血清中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、熒光定量RT-PCR等[4-15]。

萊蕪豬是我國華北型地方豬種黃淮海黑豬的一個類群，具有繁殖率高、哺育力強、耐粗料、抗病性強、雜交優(yōu)勢明顯、肉質細嫩香醇等特性，近年來作為優(yōu)良地方品種豬得到了大規(guī)模養(yǎng)殖。本試驗是將PRRSV接種到萊蕪黑豬健康仔豬體內，利用TaqMan探針熒光定量RT-PCR方法以檢測PRRSV在體內的分布及增殖規(guī)律變化，為進一步研究該病毒的致病機理，科學防控該病在萊蕪黑豬中的感染提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株及實驗動物高致病性PRRSV JXl43變異株由山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室保存；40日齡健康仔豬購自萊蕪黑豬保種基地豬場。

1.2 主要試劑High Pure RNA Tissue Kit、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 和 FastStart TaqMan Probe Master購自Roche公司；質粒提取試劑盒購自TaKaRa公司。

1.3 引物和探針的合成按GeneBank中發(fā)表的參考序列，在保守區(qū)分別設計引物和探針，由上海金斯瑞生物科技有限公司合成。PRRSV-F:5'-CGGCAAAT ATAACCACGC-3'，PRRSV-R:5'-TTCTGCCACCCAACACGAG-3'；另外，針對ORF7基因序列設計一對制備標準品的引物:PF:5'-CCTTCGGGTACATGACATTCGT-3'；PR:5'-TTGCTGCTTGCCGTTGTTATT-3'；探針PRRSV-P序列為:5'-FAM-TGCCGTTGACC GTAGTGGAGCC-TAMRA-3'。

1.4 陽性標準品的制備用常規(guī)PCR反應擴增PRRSVORF7基因，用DNA回收試劑盒回收目的片段，然后連接到pMD18-T載體中，轉化DHl0α感受態(tài)細胞。陽性重組質粒經EcoRⅠ酶切鑒定后，由上海生工生物工程有限公司測序。提取質粒的大約濃度為7×1010copies/μL。

1.5 熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化用矩陣法對熒光定量PCR 的循環(huán)參數(shù)、引物和探針濃度以及所選引物與探針的組合等進行篩選優(yōu)化，以得到最佳的熒光定量PCR反應條件。

1.6 標準曲線的繪制以10倍稀釋已知拷貝數(shù)的質粒為模板，經熒光定量PCR儀檢測，得到動力學曲線，并計算出相應的標準曲線。

1.7 靈敏性試驗將已計算出拷貝數(shù)的含目的基因的質粒做10倍梯度稀釋，稀釋至用熒光定量PCR儀不能檢出，以此計算出熒光定量PCR所能檢出的最低模板拷貝數(shù)。

1.8 特異性試驗以豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、日本乙型腦炎（Japanese encephalitis virus，JEV）、圓環(huán)病毒 2 型（Porcine circovirus ，PCV2）和PRRSV JXl43株的核酸為模板，應用優(yōu)化的熒光定量PCR條件進行特異性試驗。

1.9 重復性試驗以 RNA 標準品（103～107拷貝 /μL）為模板，進行重復性試驗。

1.10 實驗動物分組及感染試驗40日齡健康萊蕪黑豬仔豬15頭，經RT-PCR和ELISA檢測為PRRSV陰性。隨機分為2組，攻毒組10頭，對照組5頭，分別人工鼻腔接種5 mL/頭PRRSV液和PBS。于攻毒后第3、7、14、21、28 d各剖殺攻毒組豬2頭，對照組豬1頭，分離心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、扁桃體、頜下淋巴結、腹股溝淋巴結和腸系膜淋巴結等組織備用。

1.11 臨床癥狀觀察及剖檢變化實驗過程中，每日觀察實驗豬的臨床癥狀，并作好記錄。每日定時測定實驗組與對照組的直腸體溫、觀察精神狀況、食欲等。剖殺時，對比觀察肺臟、肝臟、腎臟和主要免疫器官，如扁桃體、下頜淋巴結、肺門淋巴結、腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結和脾臟等。

1.12 病毒RNA的提取及反轉錄取感染后不同時間采集的各器官，按照 High Pure RNA Tissue Kit說明書提取總RNA。利用隨機引物進行反轉錄，程序為:25℃ 10 min，55℃ 1 h，85℃ 5 min。

1.13 各組織中病毒載量的檢測以各組織反轉錄產物為模板進行熒光定量RT-PCR檢測。

2 結果與討論

2.1 熒光定量PCR反應條件熒光定量PCR反應液用Roche 公司生產的 FastStart TaqMan Probe Master試劑盒。篩選出的最佳反應體系:RNA模板2 μL，PRRSV-F/PRRSV-R（10 pmol/μL） 各 1 μL，TaqMan 探針（10 pmol/μL）0.4 μL。循環(huán)參數(shù):95℃ 1 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40 個循環(huán)；每個循環(huán)后檢測熒光。

2.2 標準曲線的建立取濃度為 104～108拷貝 /μL 的標準品模板進行熒光定量PCR擴增并建立標準曲線。得到的標準曲線方程為y=-3.1843x+39.241867，相關系數(shù)為R2=0.99，見圖1。

圖1 繪制的標準曲線Fig.1 The standard curve established from the abovemention result

2.3 靈敏性試驗將系列稀釋的RNA標準品，用建立的熒光定量PCR方法進行檢測，結果顯示本方法比普通PCR方法高10～100倍，具有較好的靈敏度。

2.4 特 異 性 試 驗CSFV、JEV、PCV2和 PRRSV JXl43核酸作為模板，利用熒光定量PCR方法進行檢測，其中，PRRSV的檢測結果為陽性，而其他病毒核酸的結果均為陰性，表明該方法具有較好的特異性。

2.5 重復性試驗用熒光定量PCR對標準品進行了重復性檢測，并對檢測結果進行了統(tǒng)計學分析。結果，見表1。

表1 PRRSV標準品的重復性測定Table 1 Ct value of PRRSV standard preparation

2.6 臨床癥狀及剖檢變化攻毒后3 d，實驗組豬出現(xiàn)不同程度的精神沉郁、食欲下降、飲水減少，部分仔豬下痢，日漸消失。攻毒后7 d，豬出現(xiàn)咳嗽、眼角分泌物增多。攻毒后14 d，實驗組豬體溫明顯升高。但整個實驗過程中并未出現(xiàn)癱瘓、耳部和皮膚發(fā)紺等藍耳病的典型癥狀。實驗組豬出現(xiàn)典型的肺出血、淤血病變、彌漫性間質性肺炎；皮下、扁桃體、肝臟均出現(xiàn)出血點和出血斑；全身淋巴結都有不同程度的淤血、出血、腫脹，有點呈現(xiàn)暗紅色（見圖2）。

圖2 萊蕪黑豬剖檢病理變化Fig.2 Anatomic pathological changes of Laiwu black pigs

2.7 各臟器和淋巴結中病毒載量萊蕪黑豬攻毒PRRSV后，不同時間各種組織中的病毒核酸拷貝數(shù)，見表2。由表2可知，攻毒后d 3各組織中均檢測到病毒核酸存在。攻毒后d 7，在各組織中病毒載量明顯增高，扁桃體、下頜淋巴結、腹股溝淋巴結和腸系膜淋巴結等淋巴組織中的病毒載量均達到107拷貝/g以上，心臟、肝臟、腎臟、脾臟、下頜淋巴結和腸系膜淋巴結在攻毒后d 7達到該組織病毒載量最高值，而肺臟和扁桃體在攻毒后d 14達到病毒載量最高，另外腹股溝淋巴結的病毒載量在攻毒后d 21 達到最高值。

整體來看，攻毒后d 7～21，各種組織中的病毒載量維持在較高水平，而攻毒后d 28時，多數(shù)組織中的PRRSV病毒含量明顯下降。扁桃體、下頜淋巴結、腹股溝淋巴結和腸系膜淋巴結等淋巴組織中的病毒載量要明顯高于其他臟器，顯示PRRSV在感染萊蕪黑豬后具有淋巴組織組織嗜性。

表2 攻毒后各組織中病毒拷貝數(shù)Table 2 Virus copies in different tissues after infection

2.8 PRRS是一種困擾我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要免疫抑制病，PRRSV單獨感染能引起免疫器官以淋巴細胞及巨噬細胞變性壞死為特征的急性炎癥變化，造成免疫損傷，進而引起免疫抑制[16]。感染PRRSV后豬體在接種其他疫苗時不能產生正常的細胞和體液免疫反應，容易繼發(fā)其他病原的感染[6]。

實時熒光定量PCR技術相對于常規(guī)PCR等病原檢測方法，不僅有著更高的特異性和靈敏度，而且大大縮短了檢測時間，還可應用于病毒隱性感染和早期感染的診斷[17]。基于SYBR Green法的熒光定量PCR分析融解曲線顯示，兩種不同型PRRSV分別得到不同的融解溫度，可用于PRRSV的流行病學調查[18]。本研究建立的Taqman探針實時熒光定量RT-PCR檢測PRRSV的方法相對于SYBR Green法具有更高的特異性，在進行PRRSV定量檢測時更加可靠。

萊蕪豬是我國華北地區(qū)優(yōu)良地方品種豬，抗病性強是其主要優(yōu)點之一。本研究以PRRSV攻毒健康萊蕪黑豬仔豬，檢測攻毒后不同時間段萊蕪黑豬各種組織中的病毒核酸載量。結果顯示，攻毒后d 3各組織器官中均檢測出低拷貝的病毒；攻毒后d 7，各組織中病毒載量明顯增高；攻毒后d 7～21，各種組織中的病毒載量維持在較高水平，而在攻毒后d 28時，多數(shù)組織中的PRRSV病毒含量明顯下降。扁桃體、下頜淋巴結、腹股溝淋巴結和腸系膜淋巴結等淋巴組織中的病毒載量在攻毒d 7后均達到107拷貝/g以上，明顯高于其他的組織，表明PRRSV感染萊蕪黑豬后各種免疫組織是其侵害的主要部位，并可能因此影響免疫組織發(fā)揮免疫調節(jié)功能，導致機體的免疫抑制。

危艷武等[15]用高致病性PRRSV變異株攻毒健康仔豬后檢測出扁桃體、淋巴結、心臟和腎臟中病毒核酸載量較高，并且扁桃體和淋巴結中病毒核酸載量明顯低于腎臟。本研究發(fā)現(xiàn)萊蕪黑豬心臟中的PRRSV病毒核酸載量在各種組織中較低，且扁桃體和淋巴結中病毒核酸載量在檢測周期中多數(shù)情況下顯著高于腎臟，推測二者差異的主要原因可能是使用的攻毒毒株以及試驗動物不同所致。本研究由于試驗動物數(shù)量所限，某些試驗數(shù)據(jù)波動較大，個體之間差異較為明顯，這與危艷武等[15]的試驗結果類似。今后的研究中增加試驗動物數(shù)量是減少個體差異、獲得更為客觀動物試驗結果的有效措施。

[1]Conzelmann K K, Visser N, Van Woensel P,et al.Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group[J].Virology, 1993, 193(1)： 329-339.

[2]姜平, 陳溥言, 蔡寶祥, 等.我國豬繁殖和呼吸綜合征病毒基因型鑒定[J].中國獸醫(yī)學報, 1999, 19(2)： 121-123.

[3]李志杰, 丁壯, 孟軻音, 等.PRRSV缺失變異毒株JL/07/SW株的分離鑒定及序列分析[J].中國獸醫(yī)學報, 2009,29(7)： 830-835.

[4]肖躍強, 管宇, 唐娜, 等.PRRSV 經典與高致病性毒株RT-PCR鑒別檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)學報, 2010,30(7)： 873-877.

[5]林華, 郭萬柱, 韓國全, 等.對PRRSV快速分型的多重RT-PCR方法的建立與應用[J].中國獸醫(yī)學報, 2011,31(1)： 6-10.

[6]牛偉, 丁壯, 王曉莉, 等.實時熒光定量PCR方法檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒[J].中國獸醫(yī)學報,2011, 31(2)： 174-177.

[7]Chen Y, Tian H, He H J,et al.Indirect ELISA with Recombinant GP5 for Detecting Antibodies to Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus[J].Virol Sin, 2011, 26(1)： 61-66.

[8]Li X S, Fu F, Lang Y K,et al.Development and preliminary application of an immunochromatographic strip for rapid detection of infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus in swine[J].J Virol Methods, 2011, 176： 46-52.

[9]婁高明, 杜偉賢, 謝明權, 等.豬繁殖與呼吸道綜合征RT-PCR 診斷方法的建立[J].中國獸醫(yī)學報, 2000,20(2)： 144-147.

[10]任慧英, 李文立, 楊漢春, 等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒cDNA 探針的制備及初步應用[J].中國獸醫(yī)學報, 2000,20(5)： 438-440.

[11]王守山, 李玉保, 孟喜龍, 等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR方法的建立[J].江西農業(yè)大學學報, 2009, 31(6)： 1074-1078.

[12]劉長龍, 張建武, 韋祖樟, 等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒TaqMan熒光定量RT-PCR方法的建立與應用[J].中國預防獸醫(yī)學報, 2010, 32(11)： 858-861.

[13]宋志軍, 宋長緒, 楊增岐, 等.豬生殖與呼吸綜合征病毒TaqMan 熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學, 2006, 36(02)： 98-102.

[14]榮福龍, 劉永剛, 孫廣力, 等.應用熒光定量RT-PCR方法檢測PRRSV變異株在仔豬體內動態(tài)分布[J].中國預防獸醫(yī)學報, 2010, 32(9)： 681-686.

[15]危艷武, 劉長明, 張朝霞, 等.熒光定量RT-PCR法對高致病性PRRSV變異株感染豬體內分布規(guī)律的研究[J].中國獸醫(yī)學報, 2010, 30(4)： 444-448.

[16]熊丁杰, 徐志文, 梅淼, 等.PRRSV 感染致斷奶仔豬肺臟和外周免疫器官的病理損傷[J].中國獸醫(yī)學報, 2011,31(5)： 725-729.

[17]Martinez E, Riera P, Sitja M,et al.Simultaneous detection and genotyping of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) by real-time RT-PCR and amplicon melting curve analysis using SYBR Green[J].Res Vet sci, 2008, 85： 184-193.

[18]Jothikumar N, Cromeans T L, Robertson B H,et al.A broadly reactive one-step real-time RT-PCR assay for rapid and sensitive detection of hepatitis E virus[J].J Virol Methods, 2006, 131(1)： 65-71.