上海市閔行區(qū)豬場中大腸桿菌O157:H7的分離鑒定及生物學特性研究

趙秋華，王少輝，劉萍萍，姚建楠，李穎利，李蓓蓓，邵東華，史子學，魏建超，馬志永

（1.上海市閔行區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201109；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）感染可引起出血性腸炎（hemorrhagic colitis，HC）、溶血性尿毒綜合征（hemolytic uremic syndrome，HUS）、 血 小 板 減少 性 紫 癜（thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP），其中，HUS和TTP的病情嚴重，病死率高。EHEC引起人類致病的最常見血清型為 O157：H7，該病原菌嚴重威脅人類健康，已成為世界性的重要的公共衛(wèi)生和食品安全問題[1,2]。1982年，該病首次在美國爆發(fā)流行，隨后在加拿大、英國、意大利、日本、愛爾蘭、比利時、德國、澳大利亞、阿根廷、南非、以色列等國家爆發(fā)和流行[3-6]。我國1986年首次報告大腸桿菌O157：H7感染的病例，主要在江蘇省、山東省、河南省、安徽省、廣西省、福建省等十幾個省市發(fā)生大腸桿菌O157：H7感染的散發(fā)病例[7]。

大腸桿菌O157：H7作為一種人獸共患病原菌，可以在畜禽中流行和傳播，并通過動物源性食品傳染給人。調(diào)查和監(jiān)測結(jié)果表明，牛、羊、豬等家畜是大腸桿菌O157：H7的天然宿主，且牛和豬是大腸桿菌O157：H7的主要宿主，陽性率高于其他動物[8]。雖然豬是大腸桿菌O157：H7的宿主，但該菌引起豬發(fā)病并不多見，多為陰性感染，但可向環(huán)境中排毒，具有潛在的食品安全隱患[9]。對上海地區(qū)豬場中大腸桿菌O157：H7進行流行病學調(diào)查，了解其毒力因子和耐藥情況，有助于控制大腸桿菌O157：H7在豬場中的流行和傳播，防止其經(jīng)動物源性食品在人間傳播。因此，本研究對采集上海地區(qū)某3個豬場豬280份樣品進行大腸桿菌O157：H7分離鑒定和生物學特性研究，將對預(yù)防和控制大腸桿菌O157：H7在豬場中的流行和傳播具有重要的獸醫(yī)公共衛(wèi)生意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 營養(yǎng)肉湯（NB）為上海科技公司產(chǎn)品；大腸桿菌O157顯色培養(yǎng)基為青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；大腸桿菌O157和H7診斷血清為寧波天潤生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；細菌微量發(fā)酵管、藥敏試紙均購自杭州天和微生物試劑有限公司；2×TaqPCR Master Mix 購自天根生化科技有限公司；Veriti 96 Well Thermal Cycler PCR 擴增儀購自Applied Biosystem公司；DYY-GC型電泳儀購自北京市六一儀器廠；凝膠成像儀購自Bio-Rad公司。

1.1.2 病料 2012年4～12月份分別采集上海市某三個豬場的豬糞便樣品和肛拭子樣品共280份。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養(yǎng) 將糞便樣品和肛拭子樣品混于 500 μL NB 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)增菌 6～8 h，劃線接種于O157顯色培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16～20 h，挑取疑似單菌落劃線在平板上劃線純化，挑取疑似單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6～8 h，進行下一步鑒定。

1.2.2 血清學鑒定 分別應(yīng)用O157和H7單因子診斷血清與待檢細菌在玻片上進行凝集反應(yīng)，測定細菌的血清型。凝集試驗以生理鹽水作為陰性對照，以大腸桿菌O157：H7標準菌株ATCC35150作為陽性對照。

1.2.3 PCR鑒定 根據(jù)O157抗原和H7抗原編碼基因（rfbE和fliC）進行雙重PCR鑒定大腸桿菌O157：H7[10,11]。移取 1 mL 增菌液至滅菌 EP 管中，10 000×g離心 5 min，棄上清，然后加入 100 μL滅菌去離子水重懸沉淀，于沸水中加熱10～15 min，再次10 000×g離心5 min，收集上清液，作為PCR反應(yīng)模板。PCR 反應(yīng)體系如下:2×PCR Master Mix 12.5 μL，引物O157-F、O157-R、H7-F、H7-R（表1）各取0.8 μL，模板（粗提DNA）2.0 μL，最后加滅菌ddH20至25 μL。同時設(shè)立陽性對照，陰性對照。PCR反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性5 min；95℃變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 40 s，35 個循環(huán)；72℃ 延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠上電泳各樣品5 μL，紫外燈下拍照，記錄PCR結(jié)果。

1.2.4 生化試驗 將細菌分別接種于腸桿菌微量生化管中，37℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果，確定菌株的各項生化特性。

1.2.5 藥敏試驗 采用紙片擴散法進行藥敏試驗。將所保存的純化菌株分別在37℃營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18～24 h，致密劃線于瓊脂平板表面，用無菌鑷子將藥敏片貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24 h后測抑菌圈直徑，根據(jù)美國臨床檢驗標準委員（CLSI）標準判定大腸桿菌O157：H7對藥敏紙片的敏感性（表2）。

表1 大腸桿菌O157: H7特異性基因檢測引物Table 1 Primers for detection of E.coli O157:H7

表2 藥物敏感性判斷標準Table 2 Primers for detection of E.coli O157:H7

1.2.6 毒力基因檢測 根據(jù)大腸桿菌O157毒力基因序列分別設(shè)計并合成引物（表 1），采用PCR檢測這些毒力基因在大腸桿菌中的分布。PCR反應(yīng)體系:2×PCR Master Mix 12.5 μL，Primer F、R 各取1.0 μL，模板（粗提 DNA）2.0 μL，最后加滅菌ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)參數(shù):95℃5 min；95℃ 30 s，56℃ 30s，72℃ 30～50s，30 個循環(huán)；72℃10 min。1.0% 瓊脂糖凝膠上電泳各樣品 5 μL，紫外燈下拍照，記錄PCR結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離培養(yǎng)大腸桿菌 O157：H7 在 O157 選擇性培養(yǎng)基上呈紅色、淡紅色或紅色菌落，菌落周圍沒有藍色暈圈，其他大腸桿菌顯暗藍色、藍色或紫色，菌落周圍有藍色暈圈；而其他細菌顯藍色、黃色或無色。280個樣品經(jīng)過O157選擇性培養(yǎng)基篩選，挑取17個疑似單菌落。

2.2 大腸桿菌O157:H7的PCR鑒定采用PCR方法檢測17株疑似菌株是否為大腸桿菌O157：H7，以ATCC35150菌株為陽性對照。結(jié)果表明來自于15和17號疑似菌株出現(xiàn)特異性條帶（圖1），表明該菌株為大腸桿菌O157：H7，分別命名為EHEC01和EHEC02。在檢測的280個樣品中，有2份細菌經(jīng)PCR鑒定為大腸桿菌O157：H7，樣本細菌分離率為0.71%。

圖1 大腸桿菌O157:H7 PCR檢測結(jié)果Fig.1 The PCR detection of E.coli O157:H7

2.2 血清學鑒定結(jié)果對PCR呈陽性的菌株進行血清學鑒定，分別將其與O157和H7診斷血清做玻片凝集試驗，結(jié)果表明該菌株與O157和H7診斷血清均出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，而與陰性對照血清和生理鹽水則均無凝集現(xiàn)象。凝集試驗結(jié)果表明分離所得的2株細菌為大腸桿菌O157：H7，與PCR結(jié)果一致。

2.3 生化試驗結(jié)果將大腸桿菌O157：H7菌株分別接種于微量生化管，培養(yǎng)后觀察。結(jié)果表明，該細菌能夠發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖和甘露醇；發(fā)酵蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；M-R試驗、吲哚試驗陽性；VP試驗、檸檬酸鹽利用試驗陰性；不產(chǎn)生硫化氫（H2S）。以上生化結(jié)果與大腸桿菌O157：H7的生化特性相符合。

2.4 藥敏試驗結(jié)果選用β-內(nèi)酰胺類抗生素、氨基糖苷類抗生素、四環(huán)素類抗生素、氯霉素類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、多肽類抗生素、氟喹諾酮類藥物和利福霉素類抗菌藥共24種抗菌藥物對分離得到的大腸桿菌O157：H7進行藥敏試驗，藥敏結(jié)果見表3。藥敏結(jié)果表明大腸桿菌O157：H7的耐藥性程度都較高，兩者對24種藥物的耐藥性均為62.5%。而敏感藥物僅有頭孢西丁（美褔仙）、頭孢他啶（復(fù)達欣）和丁胺卡那霉素3種。

2.5 毒力因子分布采用PCR方法對大腸桿菌O157：H7分離株的主要毒力基因（stx1、stx2和eae）進行檢測，結(jié)果顯示兩株大腸桿菌O157：H7均含有eae基因。EHEC01分離株含有stx1基因，提示其只攜帶1型志賀毒素；而EHEC02分離株不攜帶志賀毒素基因（圖2）。

表3 大腸桿菌O157:H7的藥敏試驗結(jié)果Table 3 Results of antibiotic sensitivity test of E.coli O157:H7

3 討論

近年來，由EHEC引起的食源性疾病在世界范圍內(nèi)許多國家都時有報道，如最近發(fā)生在德國由豆苗污染引起的EHECO104：H4暴發(fā)事件，導(dǎo)致2000多人感染，約數(shù)十人死亡，這次疫情對整個歐洲都造成了一定的影響[12]。EHEC主要包括O157：H7、O26：H11和 O111等血清型，其中 O157：H7是最重要的一種血清型。研究表明，家畜家禽是大腸桿菌O157：H7的主要動物宿主和傳染源，其中最主要的宿主為牛，其次為羊、豬、禽類[8]。因此，本文對上海地區(qū)豬場中大腸桿菌O157：H7的分布及生物學特性進行研究，有助于控制大腸桿菌O157：H7在畜禽中的流行和傳播，防止其經(jīng)動物源性食品傳染給人。

圖2 毒力基因檢測結(jié)果Fig.2 The results of PCR for detection of virulence genes

本文采用增菌、選擇性培養(yǎng)基篩選、PCR鑒定的方法分析大腸桿菌O157：H7在280份豬場樣品中的分布。結(jié)果從不同豬場的2份斷奶腹瀉仔豬的糞便樣本中分離鑒定出大腸桿菌O157：H7，分離率為 0.71%（2/280）。Yan等[13]對 2005-2006年 上海奉賢區(qū)不同豬場的糞便樣品中大腸桿菌O157進行流行病學調(diào)查，結(jié)果表明1.1%的樣品含有大腸桿菌O157，其于分離率高的原因在于僅檢測大腸桿菌 O157（包括 O157：H7 和 O157：NM）。王建等[14]檢測2003-2004年上海地區(qū)動物及其產(chǎn)品中大腸桿菌O157：H7帶菌情況，結(jié)果表明5.71%的豬糞便樣品攜帶大腸桿菌O157：H7。顧寶柯等[15]的檢測結(jié)果表明，2000-2001年上海地區(qū)豬糞便中大腸桿菌O157：H7的檢出率為3.4%，其中2000年和2001年的檢出率分別為1.4%和5.67%。楊麗華等[16]檢測了上海市閔行區(qū)家禽畜大腸桿菌O157：H7帶菌狀況，豬糞中大腸桿菌O157：H7的陽性率高達9.76%。造成大腸桿菌O157：H7不同的檢出率的原因可能為不同時間、不同豬場、不同采樣方法。

志賀毒素（Stx1、Stx2）和緊密素（Intimin）是EHECO157的主要致病因子，其分別由stx1、stx2和eae基因編碼，是判斷EHEC O157菌株致病力強弱的重要因素[17]。自然界中存在的大腸桿菌O157有的產(chǎn)毒，而有的不產(chǎn)毒，它們對人的致病性有很大差異，但是表型幾乎相同，用傳統(tǒng)的血清學方法也難以分辨，本文采用簡便、快速、特異的PCR方法檢測分離菌株所攜帶的主要毒力基因進行檢測，更加清楚的了解了每個菌株的毒力特性。志賀毒素是EHEC重要的毒力因子之一，具有細胞毒性、腸毒性和神經(jīng)毒性，是導(dǎo)致感染者死亡或出現(xiàn)重型病癥的主要原因。目前認為EHECO157：H7之所以能對人類引起如此大的危害，其主要都是志賀毒素的作用[17]。本次分離鑒定的EHECO157：H7菌株均不攜帶Stx2，而僅EHEC01含有Stx1，這與相關(guān)報道中的結(jié)果相比稍低[18]，其原因可能由于不同來源的菌株具有不同的特性。LEE毒力島上的重要毒力基因eae編碼的緊密素是導(dǎo)致腸道出現(xiàn)典型粘附與消除損傷的主要致病因子，本次分離的兩個菌株都含有eae基因，這一結(jié)果與“eae基因在EHEC菌株中廣泛存在”的說法[18]是一致的。

本研究對分離的EHECO157：H7進行體外藥敏試驗，結(jié)果表明2株EHECO157：H7均具有很強的多重耐藥性，僅對頭孢西丁（美褔仙）、頭孢他啶（復(fù)達欣）和丁胺卡那霉素3種藥物敏感。濫用抗生素可導(dǎo)致細菌產(chǎn)生耐藥性，給養(yǎng)豬業(yè)的疾病控制帶來了極大的危害，并有可能通過食物鏈將耐藥性基因傳遞給人類。由于EHEC致病機理的特殊性，濫用抗生素不僅難以控制病情，還會促進志賀毒素的釋放，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，增加了疾病的控制難度。因此，使用抗生素控制病情時，要在科學分析的基礎(chǔ)上，選用合適的防控方法。

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