免疫印跡法檢測胰島自身抗體系列在糖尿病分型診斷中的應(yīng)用

邱 陽 郭慧淑 劉越堅(jiān) 單路娟 郭 莉 (大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116011)

糖尿病的早期診斷和分型在其治療和預(yù)后中顯示出十分重要的作用。1型糖尿病(T1DM)是由于自身免疫損傷胰島β細(xì)胞，從而使胰島素敏感性降低或分泌減少的疾病?；颊唧w內(nèi)存在多種針對胰島β細(xì)胞的自身抗體，其中血清谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)、抗胰島β細(xì)胞抗體(ICA)、抗胰島素自身抗體(IAA)是極為重要的三種指標(biāo)〔1〕，其地位和作用已得到認(rèn)可。本文應(yīng)用免疫印跡法(IB)聯(lián)合檢測上述三種抗體，分析并探討其對糖尿病分型診斷的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 實(shí)驗(yàn)組為2008年3月至2012年12月來本院內(nèi)分泌科就診的門診及住院患者187例，其中T1DM 69例，男39例，女30例，年齡11～40〔平均 (23±12)〕歲;2型糖尿病 (T2DM)118例，男62例，女56例，年齡33～72〔平均 (52±18)〕歲，半年內(nèi)未用胰島素。所有病例均經(jīng)臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查后按1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)確診，并排除繼發(fā)性和妊娠糖尿病。健康對照組為2011年9月來本院體檢的健康者30例，其中男13例，女17例;年齡25～57〔平均 (41±14)〕歲，空腹血糖均在正常范圍內(nèi)，且無糖尿病家族史和自身免疫病史。

1.2 方法

1.2.1 采血 清晨空腹采靜脈血，37℃放置 30 min，3 000 r/min離心10 min，分離血清，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗體測定 采用免疫印跡法測定GADA、ICA、IAA，試劑盒購于深圳伯勞特生物制品有限公司。操作過程:(1)取出試劑盒，室溫平衡。在含有印跡膜條的反應(yīng)槽中加入1 ml工作液，水平振蕩5 min后加入待檢血清 10 μl，再次水平振蕩30 min。(2)棄去槽中液體，每槽中加入1 ml洗滌應(yīng)用液洗滌5 min，棄去液體。重復(fù)洗滌三次。(3)每槽中加入1 ml工作液及20 μl酶聯(lián)試劑，水平振蕩器上振蕩0.5 h。(4)洗滌同步驟(2)。(5)每槽中加入顯色劑1 ml，水平振蕩器上振蕩10 min。(6)顯色清楚后，棄去顯色劑液，用自來水反復(fù)沖洗。(7)取出印跡膜條，晾干后與標(biāo)準(zhǔn)帶對照判定結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

免疫印跡法檢測69例TIDM型糖尿病患者，其中GADA陽性45例(65.22%)，ICA陽性37例(53.62%)，IAA陽性20例(28.99%)。在118例T2DM型糖尿病患者中，GADA陽性15例(12.71%)，ICA陽性 13例(11.02%)，IAA陽性 7例(5.93%)。在30例健康體檢者中，只有ICA陽性1例，其余均為陰性。由此可見，T1DM組胰島自身抗體的陽性檢出率明顯高于T2DM組及正常對照組(P＜0.05)。在T1DM組中，3種抗體檢出的陽性率依次為GADA＞ICA＞IAA，同時(shí)3種抗體聯(lián)合檢測的陽性率也明顯高于單項(xiàng)檢測(P＜0.05)。

3 討論

糖尿病是一種代謝綜合征，在臨床上常見且多發(fā)。糖尿病分型方法雖經(jīng)多次修訂〔2～4〕，但仍然不盡如人意。最常用的是按照世界衛(wèi)生組織及國際糖尿病聯(lián)盟專家組的建議，將糖尿病按病因分型分為1型、2型、其他特殊類型及妊娠糖尿病4種〔5〕。以往主要依據(jù)患者臨床表現(xiàn)和血清胰島素水平，這種分型方法對成人隱匿性免疫糖尿病(LADA)不易察覺，具有一定的局限性。近年來隨著糖尿病免疫標(biāo)志物的出現(xiàn)，臨床分型有依賴于血清免疫標(biāo)志物檢測的趨勢。目前用于糖尿病診斷的血清免疫標(biāo)志物主要有 GADA、ICA、IAA〔6〕。

T1DM患者在無癥狀以及發(fā)病后一段時(shí)期內(nèi)可檢出多種針對胰島β細(xì)胞的自身抗體，如GADA、ICA、IAA、酪氨酸磷酸酶抗體(IA)等，每一種抗體和T1DM的發(fā)生、發(fā)展都密切相關(guān)。GADA是合成γ氨基丁酸(GABA)的限速酶，在胰島β細(xì)胞中與胰島素同時(shí)存在，在患者出現(xiàn)T1DM臨床表現(xiàn)前數(shù)年甚至10余年即可出現(xiàn)，與β細(xì)胞慢性損傷的相關(guān)性好、持續(xù)時(shí)間長、陽性率高〔7〕。作為LADA預(yù)測的早期診斷指標(biāo)，ICA是針對胰島細(xì)胞內(nèi)具有的胞質(zhì)成分多種抗原的混合抗體，當(dāng)這種抗體和胰島細(xì)胞的表面抗原結(jié)合后可引起免疫反應(yīng)，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，最終引起細(xì)胞的溶解和死亡而導(dǎo)致糖尿病;新發(fā)的T1DM中陽性率為65%～85%，隨著病程延長，陽性率逐漸降低。因此對少年起病的T1DM早期有較高的診斷價(jià)值〔8〕。IAA是針對內(nèi)源性胰島素的抗體，也是唯一針對胰島β細(xì)胞的一類特異性抗體。在糖尿病自身抗體中，IAA出現(xiàn)最早，持續(xù)時(shí)間較短〔9〕。有國外文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)典T1DM患者IAA陽性率可達(dá)70%〔10〕，對T1DM診斷有較好的敏感性。IAA絕大部分與胰島素結(jié)合成復(fù)合物而使其失去生物活性，因此IAA的測定能為治療糖尿病提供重要依據(jù)，也是評價(jià)藥用胰島素的理想指標(biāo)。

目前主要是采用放射免疫法、放射配體法、酶聯(lián)免疫法等檢測糖尿病分型的抗體。本組研究采用的免疫印跡技術(shù)是將凝膠電泳(SDS-PAGE)的高分辨率和免疫學(xué)反應(yīng)的高特異性有效結(jié)合的一種新的分子生物學(xué)免疫技術(shù)。此方法首先利用聚丙烯酰胺凝膠電泳將生物活性物質(zhì)高效分離，然后通過電轉(zhuǎn)移將其轉(zhuǎn)印在硝酸纖維膜 (NC膜)上，與待檢血清反應(yīng)，若血清中含有相應(yīng)抗體，則抗原抗體結(jié)合，再分別加入酶聯(lián)二抗和顯色劑，相應(yīng)抗原位置即出現(xiàn)顯色區(qū)帶，與標(biāo)準(zhǔn)區(qū)帶比較，判定結(jié)果。該方法即保持了高分辨率又不失去原有抗原性，以便進(jìn)行各種生物控制、免疫識別、掃描和保存。具有不同分子量的抗原包被于同一印記條，可以同時(shí)聯(lián)合檢測ICA、GADA、IAA 3種自身抗體，提高檢出率〔11〕，而且無需特殊設(shè)備，操作簡單方便，時(shí)間短，重復(fù)性好，是糖尿病自身抗體檢測的一種簡便有效的方法。本研究顯示，免疫印跡法檢測T1DM組GADA、ICA、IAA陽性率明顯高于T2DM組和對照組，說明三種抗體是鑒別T1DM和T2DM及預(yù)測和早期診斷T1DM的重要指標(biāo)。

1 郭 莉，單路娟，邱 陽，等.糖尿病患者血清GAD-Ab、ICA、IAA聯(lián)合檢測的臨床意義〔J〕.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004;26(2):136-8.

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