昆明石杉中非生物堿類成分研究

李齊激， 鄒 娟， 李繼新， 張敬杰， 劉亞華， 潘爐臺*

(1.貴陽中醫(yī)學院，貴州 貴陽 550002;2.貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550002)

昆明石杉Huperzia kunmingensisChing為石杉科石杉屬蕨類植物，我國特有種，分布于我國云南、貴州、廣西。味苦、辛，性微溫，具有益智醒神，化瘀止血的功效，主要用于治療健忘，神志不清，跌打損傷等［1-3］。對該屬植物的研究已取得許多翔實的研究資料，主要集中在物質(zhì)基礎、質(zhì)量分析、藥理藥效及臨床應用方面［4-8］。前期測定該植物中石杉堿甲的量 (為0.03%)［9］時，發(fā)現(xiàn)該植物除含生物堿外，非生物堿類成分也十分豐富，且迄今未見該植物的化學成分研究報道。本實驗主要對該植物中非生物堿類成分進行研究。

1 儀器和材料

Varian INOVA—400型核磁共振波譜儀 (美國Varian有限公司);XRC—1顯微熔點測定儀 (溫度未校正，四川大學科儀廠);WFH—203B型三用紫外分析儀 (上海精特實業(yè)有限公司);Buchi R—215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (瑞士 Buchi有限公司);Metter-Toledo電子天秤 (瑞士 Metter-Toledo公司);Sephadex LH-20(瑞士Pharmacia＆Upjohn公司);制備薄層 (GF254)及柱層析用硅膠 (200～300目)均購自青島海洋化工有限公司;NMR測試溶劑為氘代試劑;其余試劑均由工業(yè)純經(jīng)重蒸處理使用。

實驗材料于2008年12月采自貴州省雷山縣，經(jīng)貴州省科學院生物研究所王培善教授鑒定為昆明石杉HuperziakunmingensisChing，憑證標本(GM200803)存放于貴陽中醫(yī)學院中藥研究所。

2 提取分離

取自然干燥的昆明石杉全草粉末0.6 kg，用95%的甲醇水浴回流提取3次 (3 h/次)，合并濾液并減壓濃縮得浸膏207.0 g。經(jīng)硅膠柱層析梯度洗脫 (石油醚-乙酸乙酯，20∶1→0∶1)得流份Fr.1～Fr.9。

Fr.3(9∶1)經(jīng)硅膠柱層析石油醚-乙酸乙酯(30∶1→5∶1)梯度洗脫，10∶1部分用TLC分析合并后過夜析出針狀晶體7(150.8 mg)，母液濃縮后經(jīng)硅膠柱層析石油醚-丙酮 (30∶1→10∶1)梯度洗脫，15∶1部分經(jīng)TLC分析合并后用丙酮、甲醇分別重結(jié)晶得化合物5(18.2 mg)、6(11.1 mg);Fr.5(8∶2)經(jīng)硅膠柱層析石油醚-乙酸乙酯 (15∶1→3∶1)梯度洗脫，8∶1部分經(jīng)Sephadex LH-20得化合物3(14.7 mg)，F(xiàn)r.7(7∶3)經(jīng)制備薄層 (石油醚-丙酮，3∶1)得化合物4(103.2 mg)，F(xiàn)r.8(5∶2)經(jīng)硅膠柱層析石油醚-丙酮 (10∶1→1∶1)梯度洗脫，5∶1部分經(jīng)TLC分析合并后用制備薄層 (石油醚-丙酮3∶1)得化合物1(98.2 mg)、2(10.1 mg)，3∶1部分合并得8(319.1 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:無色方晶 (甲醇)，mp 235～236℃，醋酐-濃硫酸反應呈陽性。1H-NMR(C5D5N，400 MHz)δ:5.93(1H，br s，H-15)，4.44(1H，br s，H-3β)，3.58(1H，br s，H-21α)，4.08(1H，br d，J=9.7 Hz，H-24)，3.85(1H，br d，J=10.4 Hz，H-24);13C-NMR(C5D5N，100 MHz)δ:34.1(C-1)，26.9(C-2)，69.9(C-3)，44.2(C-4)，50.2(C-5)，19.8(C-6)，45.8(C-7)，38.3(C-8)，62.7(C-9)，38.6(C-10)，25.9(C-11)，26.7(C-12)，59.1(C-13)，163.7(C-14)，128.9(C-15)，201.4(C-16)，59.5(C-17)，44.7(C-18)，32.0(C-19)，25.3(C-20)，75.9(C-21)，37.6(C-22)，23.7(C-23)，65.8(C-24)，16.6(C-25)，20.0(C-26)，55.6(C-27)，15.2(C-28)，22.2(C-29)，29.1(C-30)。與文獻［10］對比，數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物1為3α，21β，24-trihydroxyserrat-14-en-16-one。

化合物2:白色針晶 (甲醇)，mp 312～313℃，醋酐-濃硫酸反應呈陽性。1H-NMR(C5D5N，400 MHz)δ:5.48(1H，br s，H-15)，3.45(1H，br d，J=7.1 Hz H-3β)，4.19(1H，dd，J=9.6，2.4 Hz，H-29)，3.96(1H，dd，J=9.6，4.1 Hz，H-29)，4.60(1H，br s，H-21α);13C-NMR(C5D5N，100 MHz)δ:39.1(C-1)，28.5(C-2)，77.9(C-3)，39.6(C-4)，56.1(C-5)，19.4(C-6)，45.6(C-7)，37.4(C-8)，63(C-9)，38.5(C-10)，25.7(C-11)，27.6(C-12)，57.6(C-13)，139.0(C-14)，122.9(C-15)，24.5(C-16)，44.8(C-17)，36.4(C-18)，31.9(C-19)，26.6(C-20)，69.7(C-21)，43.5(C-22)，28.8(C-23)，16.1(C-24)，16.4(C-25)，20.1(C-26)，56.6(C-27)，14.7(C-28)，65.0(C-29)，23.1(C-30)。與文獻［11］對比，數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物2為 serrat-14-en-3β，21β，29-triol。

化合物3:白色針晶 (三氯甲烷)，mp 297～298℃，醋酐-濃硫酸反應呈陽性。1H-NMR、13CNMR及DEPT譜揭示該化合物含30個碳原子，1H-NMR δ 5.34(1H，br s)提示含環(huán)內(nèi)雙鍵，3.18(1H，dd，J=11.2，4.5 Hz)，3.23(1H，dd，J=11.1，4.7 Hz)暗示該化合物連結(jié)有2個羥基，其偶合常數(shù)揭示 H-3、H-21分別為 α、β 構(gòu)型［12］;13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:38.4(C-1)，25.1(C-2)，78.8(C-3)，38.0(C-4)，55.6(C-5)，18.7(C-6)，45.0(C-7)，38.7(C-8)，57.0(C-9)，36.1(C-10)，25.1(C-11)，27.3(C-12)，62.7(C-13)，138.1(C-14)，122.0(C-15)，23.9(C-16)，49.3(C-17)，38.5(C-18)，29.5(C-19)，27.1(C-20)，78.5(C-21)，37.0(C-22)，15.6(C-23)，19.6(C-24)，27.9(C-25)，15.2(C-26)，55.9(C-27)，13.2(C-28)，27.2(C-29)，14.4(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻［12］對比，數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物3為 serrat-14-en-3β，21α-diol。

化合物 4:無色片晶 (丙酮)，mp 280～282℃，醋酐-濃硫酸反應呈陽性。與化合物3相比，除H-15化學位移δ 5.33(1H，br s)，H-3α為3.18(1H，dd，J=11.1，4.2 Hz)不變外;1H-NMR不同之處在δ 3.43(1H，br s)所呈現(xiàn)的寬單峰(br s)，提示該化合物H-21為α構(gòu)型［12］;在13C-NMR譜中，C-21位化學位移比化合物3小約2.00也證實該化合物C-21位與3構(gòu)型相反，與3是同分異構(gòu)體;13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:38.6(C-1)，28.1(C-2)，78.8(C-3)，38.2(C-4)，55.7(C-5)，18.9(C-6)，45.2(C-7)，37.1(C-8)，62.9(C-9)，38.9(C-10)，25.4(C-11)，27.2(C-12)，56.9(C-13)，138.5(C-14)，122.1(C-15)，23.9(C-16)，43.4(C-17)，36.0(C-18)，31.2(C-19)，25.2(C-20)，76.2(C-21)，37.4(C-22)，27.6(C-23)，15.4(C-24)，15.7(C-25)，19.8(C-26)，56.2(C-27)，13.3(C-28)，21.8(C-29)，27.7(C-30)。上述數(shù)據(jù)與文獻［13］對比，數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物4為21-epi-serratenediol。

化合物5:無色塊晶 (丙酮)，mp 316～318℃，醋酐-濃硫酸反應呈陽性。與化合物3比較，除1H-NMR δ 4.46(1H，dd，J=11.3，5.1 Hz，H-3α)增大約1.20和在δ 2.05(3H，s)多出一個乙酰基甲基信號外，其 δ 5.33(1H，br s，H-15)，3.23(1H，br s，H-21β)基本不變，在碳譜中多出一個羰基和一個乙酰甲基信號也從側(cè)面證明該化合物在C-3位比化合物3多連結(jié)了一個乙?；?13CNMR(CDCl3，100 MHz)δ:37.1(C-1)，27.2(C-2)，80.8(C-3)，37.1(C-4)，57.2(C-5)，18.8(C-6)，44.9(C-7)，38.5(C-8)，62.6(C-9)，38.0(C-10)，24(C-11)，27.5(C-12)，55.8(C-13)，138.1(C-14)，122.2(C-15)，23.8(C-16)，49.5(C-17)，37.9(C-18)，36.1(C-19)，25.2(C-20)，79.2(C-21)，38.3(C-22)，27.7(C-23)，14.6(C-24)，15.8(C-25)，19.8(C-26)，55.9(C-27)，13.4(C-28)，16.6(C-29)，28.1(C-30)，171.0，21.3(3β-OAc)。以上數(shù)據(jù)與文獻［14-15］對比，數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物5為 serratenediol-3-acetate。

化合物6:無色片晶 (甲醇)，mp＞300℃，醋酐-濃硫酸反應呈陽性。與化合物4相比，除C-3位1H-NMR譜化學位移δ 4.45(1H，dd，J=11.4，4.9 Hz，H-3α)增大1.20及δ 2.04(3H，s)乙酰基甲基信號外，其 δ 5.32(1H，br s，H-15)，3.45(1H，t，J=4.3Hz，H-21α)基本不變，C-21位的碳譜化學位移數(shù)據(jù)約比化合物3、5小2.00，進一步證明C-21位為β構(gòu)型，與化合物5為同分異構(gòu)體;13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:37.5(C-1)，24.0(C-2)，80.9(C-3)，37.2(C-4)，55.8(C-5)，19.8(C-6)，43.4(C-7)，38.3(C-8)，62.8(C-9)，36.2(C-10)，25.2(C-11)，27.7(C-12)，56.9(C-13)，138.5(C-14)，122.2(C-15)，23.9(C-16)，45.1(C-17)，38.9(C-18)，31.2(C-19)，25.5(C-20)，76.2(C-21)，37.1(C-22)，28.1(C-23)，16.6(C-24)，18.8(C-25)，21.8(C-26)，56.2(C-27)，13.3(C-28)，15.8(C-29)，27.2(C-30)，171.0，21.3(3β-OAc)。上述數(shù)據(jù)與文獻［15］對比，數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物6為21-epi-serratenediol-3-acetate。

化合物7:無色針晶 (甲醇)，醋酐-濃硫酸反應呈陽性。在多種溶劑系統(tǒng)下進行TLC比較，其Rf值及顯色與β-谷甾醇對照品一致，故鑒定化合物7為β-谷甾醇。

化合物8:白色粉末，醋酐-濃硫酸反應呈陽性。在多種溶劑系統(tǒng)下進行TLC比較，其Rf值及顯色與β-胡蘿卜苷對照品一致，故鑒定化合物8為β-胡蘿卜苷。

［1］王培善，王筱英.貴州蕨類植物志［M］.貴陽:貴州科技出版社，2001:367.

［2］潘爐臺，趙俊華，孫慶文.貴州藥用蕨類植物［M］.貴陽:貴州科技出版社，2012:30.

［3］羅迎春，趙能武，趙俊華，等.黔產(chǎn)石杉科、石松科藥用蕨類植物的種類和分布研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36(29):12729.

［4］裴 剛，何桂霞，周樸華，等.不同產(chǎn)地皺邊石杉中石杉堿甲的含量研究［J］.中成藥，2003，25(11):891-893.

［5］王 峻，潘勝利.千層塔的23種原植物中石杉堿甲含量［J］.中國藥學雜志，2009，44(16):1212-1214.

［6］王雨鑫，王炳璋，劉振麗，等.高效液相色譜法測定石杉堿甲滴眼液中石杉堿甲［J］.中成藥，2011，33(12):2097-2099.

［7］唐 宇，賀福元，劉 姹，等.正交試驗法優(yōu)選石杉堿甲胃漂浮片處方的研究［J］.中成藥，2010，32(4):594-596.

［8］馬 燮，劉麗娟，楊 虎，等.微波輔助萃取蛇足石杉總生物堿的工藝研究［J］.中成藥，2008，30(10):1544-1546.

［9］李齊激，鄒 娟，王 沖，等.高效液相色譜法測定昆明石杉中石杉堿甲的含量［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(8):1961-1962.

［10］Zhang Z，EISohly H N，Jacob M R，et al.Natural products in-hibitingCandida albicanssecreted aspartic proteases fromLycopodium ernuum［J］.J Nat Prod，2002，65(7):979-985.

［11］Zhou Hui，Li Yunsen，Tong Xiaotian，et al.Serratane-type triterpenoids fromHuperzia serrata［J］.Nat Prod Res，2004，18(5):453-459.

［12］Fang Jimmin，Tsai Weiyu，Cheng Yushia.Serratene triterpens fromPinus armandiiBark［J］.Phytochemistry，1991，30(4):1333-1336.

［13］蔣金和，劉 瑩，王利勤，等.蛇足石杉化學成分的研究［J］.云南師范大學學報，2010，30(3):59-65.

［14］裴 剛，周樸華，何桂霞，等.皺邊石杉脂溶性化學成分的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2004，16(3):213-214.

［15］李 軍，韓燕藝，劉嘉森.千層塔中三萜成分的研究［J］.藥學學報，1988，23(7):549-552.