食管癌腫瘤標(biāo)記物miRNA的研究進(jìn)展

楊志平 張 芳 楊志英 盛 望 (北華大學(xué)附屬醫(yī)院消化科，吉林 吉林 320)

腫瘤標(biāo)記物是腫瘤在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生和釋放某些特定類型的化學(xué)物質(zhì)，可以通過檢測(cè)其含量來判斷腫瘤的存在以及其生長(zhǎng)情況，并以此作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，療效評(píng)估以及預(yù)后判定。腫瘤標(biāo)記物存在形式有多種，可分為腫瘤細(xì)胞分泌物以及腫瘤細(xì)胞表達(dá)物。microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度約為17～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈核糖核酸分子。miRNA在動(dòng)物體內(nèi)通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)劑方式作用于靶基因，參與細(xì)胞的增殖、分化、代謝、凋亡等過程。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)具有明顯的組織細(xì)胞特異性，且與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切聯(lián)系。Lawrie等〔1〕在檢測(cè)腫瘤患者外周血的過程中發(fā)現(xiàn)miRNA的存在，且發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生有一定的相關(guān)性，這提示miRNA可作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物。食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，據(jù)中國(guó)腫瘤登記中心發(fā)布的《2012年中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》顯示，食管癌腫瘤發(fā)病率居第五位，死亡率居第四位。同時(shí)其在世界范圍內(nèi)發(fā)病率也居高不下〔2〕。miRNA與食管癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系非常密切，通過檢測(cè)食管癌組織miRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)其在正常組織與腫瘤組織中的表達(dá)水平具有明顯的差異〔3～6〕。通過研究這些不正常的miRNA，將有助于進(jìn)一步闡明食管癌的發(fā)病機(jī)制，并將有助于食管癌癌變組織的檢測(cè)、診斷、治療以及預(yù)后的判斷。本文將對(duì)作為食管癌腫瘤標(biāo)記物的miRNA的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 miRNA的形成及其功能

miRNA基因在細(xì)胞核內(nèi)由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄后形成初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(pri-RNAs)。pri-miRNAs的特征是前段含有一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，類似發(fā)夾，長(zhǎng)度約100nt。pri-miRNAs在細(xì)胞核內(nèi)由微處理體協(xié)助的一種RNaseⅢ(RNA內(nèi)切酶Ⅲ)-Drosha及其輔助因子DGCRb的作用下，合成約70個(gè)核苷酸長(zhǎng)的 miRNA前體pre-miRNAs，通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5(Exportin-5)轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核至細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中，由RNaseⅢ-Dicer酶的作用下將成熟的 miRNA從環(huán)結(jié)構(gòu)中剪切下來，加工成19～25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的成熟miRNA。

成熟的miRNA形成后，在細(xì)胞中可以與蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA induced silencing complex，RISC)〔7，8〕。RISC 與靶 mRNA 基因不完全配對(duì)時(shí)，可以阻斷miRNA的翻譯過程，降低表達(dá);RISC與靶mRNA完全配對(duì)時(shí)，則可以導(dǎo)致mRNA的降解。miRNA通過阻斷或者降解的mRNA表達(dá)來控制靶基因的表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)控基因的分化、凋亡等一系列的過程。

2 miRNA與腫瘤

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與基因密不可分，環(huán)境因素以及遺傳等的因素都可以導(dǎo)致或者引起DNA的變化，從而激活原癌基因或引起腫瘤抑制基因的滅活，引起基因表達(dá)水平的異常，使靶細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，超過50%的miRNA基因位于原癌基因/抑癌基因的染色體脆性位點(diǎn)(fragile sites)或相關(guān)遺傳區(qū)域〔9〕。miRNA基因往往在腫瘤中發(fā)生異常表達(dá)，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中能夠作為致癌因子或抑制因子參與腫瘤的各個(gè)過程，對(duì)比腫瘤細(xì)胞與正常組織細(xì)胞間來源的miRNA發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)譜具有明顯差異〔10～12〕。因此，其在腫瘤診斷以及判斷預(yù)后等方面具有重要的參考價(jià)值。

2.1 miRNA抑癌基因的作用 Calin等〔13〕人首先發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤的發(fā)生過程中起到抑癌作用。在將近65%的慢性淋巴性白血病，50%的套細(xì)胞淋巴瘤患者，16% ～40%的骨髓瘤患者，60%的前列腺癌患者中都有miR-16a和miR-15a基因的缺失或表達(dá)下調(diào)。而研究表明，miR-15a和miR-16a可以負(fù)調(diào)控抗bcl-2的表達(dá)，bcl-2是miR-15a和miR-16a的下游靶基因，其作為抗凋亡基因參與多種腫瘤的發(fā)生過程。miR-15a及miR-16a的表達(dá)下調(diào)將直接導(dǎo)致bcl-2的過表達(dá)，受損細(xì)胞正常凋亡程序被破壞，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞繼續(xù)復(fù)制，從而產(chǎn)生腫瘤。另?yè)?jù)研究，miR-143、miR-145在直腸癌、前列腺癌等腫瘤中均呈低表達(dá)。miRNAs中的let-7是一類典型的具有抑癌作用的分子家族，Takamizawa等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，let-7在肺癌、肝癌患者中呈現(xiàn)低表達(dá)，而其對(duì)應(yīng)的靶基因RAS是一種原癌基因出現(xiàn)高表達(dá)，可推測(cè)出let-7通過對(duì)RAS的負(fù)調(diào)控參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

2.2 miRNA致癌基因的作用 與正常細(xì)胞組織中miRNA的表達(dá)相比，miRNA致癌基因在腫瘤細(xì)胞中一般會(huì)過表達(dá)，通過促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化，抑制細(xì)胞的正常凋亡過程，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。Marilena等〔15〕對(duì)六種實(shí)體瘤(包括肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和前列腺癌)的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行了分析，結(jié)果表明miR-21是唯一在所有腫瘤中呈高表達(dá)的miRNA。隨后，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-21在頭頸部癌、卵巢癌、肝細(xì)胞癌和宮頸癌等組織樣本和細(xì)胞株中表達(dá)顯著增高〔16～20〕。Hatley 等〔21〕檢測(cè)了多組食管鱗癌與正常組織中miR-21的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-21調(diào)控基因及其蛋白過表達(dá)，且伴隨有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者表達(dá)尤其明顯，提示miR-21具有癌基因作用。MiR-155在淋巴瘤組織中表達(dá)增高，miR-222，miR-221在甲狀腺瘤組織中高表達(dá)，這些基因都可導(dǎo)致抑癌基因的活性，可以導(dǎo)致癌癥發(fā)生。

3 miRNA與食管癌

3.1 miRNA在食管癌中的表達(dá) 食管癌是世界衛(wèi)生組織公布的高發(fā)病率的惡性腫瘤之一，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)食管腫瘤的發(fā)生與miRNA有關(guān)。目前研究主要集中在miR-21、miR-143、miR-203、miR-375、miR-328、miR-196a、miR-106b-25 等miRNA的異常表達(dá)〔22〕。Guo等〔23〕研究了51例食管鱗癌組織中miRNA的表達(dá)，與癌旁正常組織中miRNA的表達(dá)情況相比，miR-25、miR-424以及miR-151的表達(dá)明顯上調(diào)，而 miR-100、miR-99a、miR-29c和miR-140則表達(dá)下調(diào)，通過比較miRNA的表達(dá)，能夠準(zhǔn)確區(qū)分食管鱗癌和正常組織。Feber等〔24〕在以miRNA表達(dá)譜作分子標(biāo)記物研究食管癌的發(fā)生發(fā)展過程實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，miR-203和miR-205在食管鱗癌和腺癌中表達(dá)低于正常的上皮細(xì)胞，而 miR-21、miR-103/107〔25〕在食管鱗癌細(xì)胞中與正常粘膜細(xì)胞比呈高表達(dá)，這些均與食管癌患者存活率不高有關(guān)。和正常食管粘膜相比，miR-200c、miR-194和miR-192在食管鱗癌中表達(dá)降低，但是在食管腺癌中表達(dá)顯著上調(diào)，表明在不同類型的食管腫瘤中存在 miRNA差異性表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)miRNA表達(dá)譜與食管癌臨床病理資料進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-335、miR-181d、miR-25、miR-7 以及 miR-495 與食管癌大體分類有關(guān)，而miR-25、miR-130b則和食管癌的高中低分化有關(guān)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)某些與食管癌患者的預(yù)后相關(guān)。陸續(xù)的研究也發(fā)現(xiàn)miRNA的異常表達(dá)與食管癌有關(guān)，且可能作為食管癌診斷的分子標(biāo)志物。miR-373在食管鱗癌中過表達(dá)，發(fā)揮致癌基因作用，通過抑制下游靶標(biāo)抑癌基因 LATS2的表達(dá)參與食管鱗癌的發(fā)生〔26〕。而miR-196a則可抑制annexin A1(ANXA1)的表達(dá)，ANXA1是抑癌基因，具有抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的作用，miR-196a通過抑制ANXA1的表達(dá)進(jìn)而引發(fā)食管癌〔27〕。

3.2 miRNA在食管癌的檢測(cè)、診斷與治療 食管癌腫瘤細(xì)胞以及癌旁正常組織中miRNA的表達(dá)量存在差別，通過檢測(cè)兩者的表達(dá)情況可以預(yù)測(cè)食管癌的發(fā)生發(fā)展過程，還可以對(duì)癌癥進(jìn)行分級(jí)評(píng)估以判定腫瘤轉(zhuǎn)移程度，為預(yù)后作出相關(guān)指示。食管癌miRNA的檢測(cè)方法主要是通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)來進(jìn)行，此方法精確度與靈敏度較高，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)miRNA的轉(zhuǎn)錄情況，被越來越多的研究者采用。Hiyoshi等〔28〕通過RT-PCR和原位雜交技術(shù)研究了21例食管鱗癌組織以及癌旁正常組織中miR-21的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與正常組織細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞中miR-21的表達(dá)明顯顯著上調(diào)，進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，miR-21可能負(fù)調(diào)控一種抑癌基因-細(xì)胞程序性死亡基因4(PDCD4)。除檢測(cè)正常組織與腫瘤組織中miRNA的表達(dá)情況外，還可以檢測(cè)血清miRNA。血清中存在大量穩(wěn)定的miRNA，其表達(dá)結(jié)果也存在顯著的差異，提示可以用來作為檢測(cè)腫瘤的標(biāo)記物。Kurashige等〔29〕檢測(cè)了71例食管鱗癌患者與39例正常人中miR-21表達(dá)情況，結(jié)果顯示 miR-21在所有食管鱗癌樣本中高表達(dá)，而在對(duì)照組中物明顯變化，患者術(shù)后的血漿中miR-21表達(dá)水平顯著下降。Akagi等〔30〕研究也證實(shí)了miR-21和miR-205在食管鱗癌組織中的高表達(dá)，且伴隨有腫瘤細(xì)胞侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者表達(dá)更明顯，證明某些特定的miRNAs與食管鱗癌的侵襲性呈正相關(guān)。而miR-143和miR-145卻在食管鱗癌細(xì)胞中表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，可以影響到腫瘤細(xì)胞的遷移過程，其與腫瘤的侵襲性呈負(fù)相關(guān)〔31〕。

食管癌的臨床治療方法主要有手術(shù)、化療和放療等方法，但是由于上述方法存在療效差，預(yù)后困難等問題。miRNA在腫瘤細(xì)胞的分化、增值、凋亡過程中具有組織特異性，其在正常組織與腫瘤組織中表達(dá)量具有明顯的差異。通過對(duì)miRNA靶基因的表達(dá)控制則可以很好解決，基因治療成為人們研究的重點(diǎn)。目前，常用的食管癌基因治療方法是通過內(nèi)源性或外源性的雙鏈RNA(ds-RNA)將RNAi導(dǎo)入細(xì)胞，RNAi是一種基因沉默工具，經(jīng)核酸酶Ⅲ(RNase III)剪切成siRNA，經(jīng)特異性的核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、解旋酶等形成RISC引起同源miRNA降解，可以抑制相應(yīng)靶基因的表達(dá)。而在腫瘤組織中起癌基因作用的miRNA，則可以通過使異常miRNA沉默導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)恢復(fù)正常，通過干擾癌基因的表達(dá)而達(dá)到治療目的。Sugito〔32〕研究發(fā)現(xiàn)，食管癌低RNASEN表達(dá)組發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比高表達(dá)組低。RNASEN含有兩個(gè)RNaseⅢ的結(jié)構(gòu)域和一個(gè)雙鏈RNA結(jié)合域，而RNaseⅢ是miRNA合成過程中重要的酶?？赏ㄟ^下調(diào)RNASEN表達(dá)，減少相關(guān)miRNA的合成，進(jìn)一步影響miRNA相關(guān)靶mRNA表達(dá)，減緩腫瘤的轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)術(shù)后生存時(shí)間。基因治療的重點(diǎn)是找到腫瘤相關(guān)的特異miRNA，目前在基因的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)方面還存在很大的困難，建立食管癌相關(guān)miRNA的表達(dá)譜系，將miRNA與食管癌腫瘤的關(guān)系進(jìn)一步明確，miRNA在食管癌的治療方面將會(huì)有更大的進(jìn)展。

4 展論

miRNAs作為一種新型的腫瘤標(biāo)記物已經(jīng)引起了人們的極大關(guān)注，同時(shí)也給與了極高的希望。目前，人們已經(jīng)對(duì)miRNAs的基本結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能有了初步的了解。miRNAs在食管癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮了重要的作用，但其調(diào)控機(jī)制尚未得到完全闡明。miRNA在食管癌的診斷、治療和預(yù)后中有巨大的利用價(jià)值。通過尋找調(diào)控miRNA的基因及其靶基因，探尋其作用機(jī)制，相信在不久的將來我們能夠研發(fā)出相應(yīng)的靶點(diǎn)藥物，為腫瘤疾病的治療帶來新的機(jī)遇。

1 Lawrie CH，Gal S，Dunlop HM，et al.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma〔J〕.J Haema-tol，2008;141(5):672-5.

2 Schoppmann SF，Asari R，Riegler M.Barrett's esophagus as a marker for increased risk for esophageal cancer and cardiorespiratory disease〔J〕.Endoscopy，2013;45(2):152-2.

3 Leidner RS，Ravi L，Leahy P，et al.The microRNAs，MiR-31 and MiR-375，as candidate markers in Barrett's esophageal carcinogenesis〔J〕.Genes Chrom Cancer，2012;51(5):473-9.

4 Fassan M，Volinia S，Palatini J，et al.MicroRNA expression profiling in human Barrett's carcinogenesis〔J〕.Int J Cancer，2011;129(7):1661-70.

5 Wijnhoven BPL，Hussey DJ，Watson DI，et al.MicroRNA profiling of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma〔J〕.Br J Surg，2010;97(6):853-61.

6 Kimura S，Naganuma S，Susuki D，et al.Expression of microRNAs in squamous cell carcinoma of human head and neck and the esophagus:miR-205 and miR-21 are specific markers for HNSCC and ESCC〔J〕.Oncol Rep，2010;23(6):1625-33.

7 Bartel DP.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function〔J〕.Cell，2004;116:281-97.

8 Hobert O.Gene regulation by transcription factors and microRNAs〔J〕.Science，2008;319(5871):1785-6.

9 Calin GA，Sevignani C，Dumitru CD，et al.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2004;101(9):2999-3004.

10 Mathé EA，Nguyen GH，Bowman ED，et al.MicroRNA expression in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the esophagus:associations with survival〔J〕.Clin Cancer Res，2009;15(19):6192-200.

11 Davis E，Caiment F，Tordoir X，et al.RNA imediated allelic transinteraction at the imprinted Rtl1/Peg11 locus〔J〕.Curr Biol，2005;15(8):743-9.

12 Castilla M，Moreno-Bueno G，Romero-Pérez L，et al.Micro-RNA signature of the epithelial-mesenchymal transition in endometrial carcinosarcoma〔J〕.J Pathol，2011;223(1):72-80.

13 Calin GA，Dumitru CD，Shimizu M，et al.Frequent deletions and downregulation of micro-RNA genes miR-15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2002;99(24):15524-9.

14 Takamizawa J，Konishi H，Yanagisama K，et al.Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival〔J〕.Cancer Res，2004;64(11):3753-6.

15 Marilena V，Chang GL，Angelo V，et al.MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer〔J〕.Cancer Res，2005;65:7065-9.

16 Iorio MV，Visone R，DiLeva G，et al.MicroRNA signatures in human ovarian cancer〔J〕.Cancer Res，2007;67:8699-704.

17 He L，Thomson JM，Hemann MT，et al.A miRNA polycistron as a potential human oncogene〔J〕.Nature，2005;435(7043):828-33.

18 Tran N，McLean T，Zhang X，et al.MicroRNA expression profiles in head and neck cancer cell lines〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2007;358(1):12-7.

19 Meng F，Henson R，Wehbe-Janek H，et al.MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer〔J〕.Gastroenterology，2007;133(2):647-58.

20 Lui WO，Pourmand N，Patterson BK，et al.Patterns of known and novel small RNAs in human cervical cancer〔J〕.Cancer Res，2007;67(13):6031-43.

21 Hatley ME，Patrick DM，Garcia MR，et al.Modulation of K-Ras-dependent lung tumorigenesis by MicroRNA-21〔J〕.Cancer Cell，2010;18(3):282-93.

22 He B，Yin BL，Wang BX，et al.MicroRNAs in esophageal cancer〔J〕.Mol Med Rep，2013;6(3):459-63.

23 Guo Y，Chen Z，Zhan GL，et al.Distinctive micmRNA profiles relating to patient survival in esophagealsquamous cell carcinoma〔J〕.Cancer Res，2008;68(1):26-33.

24 Feber A，Xi L，Luketich JD，et al.MicroRNA expression profiles of esophageal cancer〔J〕.Thorac Cardiovasc Surg，2008;135(2):255-60.

25 Akao Y，Nakagawa Y，Hirata I，et al.Role of anti-oncomirs miR-143 and-145 in human colorectal tumors〔J〕.Cancer Gene Ther，2010;17(6):398-408.

26 Lee KH，Goan YG，Hsiao M，et al.MicroRNA-373(miR-373)posttranscriptionally regulates large tumor suppressor，homolog 2(LATS2)and stimulates proliferation in human esophageal cancer〔J〕.Exp Cell Res，2009;315(15):2529-38.

27 Zhu L，Yan W，Canales R，et al.MicroRNA analysis of microdissected normal squamous esophageal epithelium and tumor cells〔J〕.Am J Cancer Res，2011;1(5):574-84.

28 Hiyoshi Y，Kamohara H，Karashima R，et al.MicroRNA-21 regulates the proliferation and invasion in esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res，2009;15(6):1915-22.

29 Kurashige J，Kamohara H，Watanabe M，et al.Serum microRNA-21 is a novel biomarker in patients with esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.J Surg Oncol，2012;106(2):188-92.

30 Akagi I，Miyashita M，Ishibashi O，et al.Relationship between altered expression levels of MIR21，MIR143，MIR145，and MIR205 and clinicopathologic features of esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Dis E-sophagus，2011;24(7):523-30.

31 Wu L，F(xiàn)an J，Belasco JG.MicroRNAs direct rapid deadenylation of mRNA〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2006;103:4034-9.

32 Sugito N，Ishiguro H，Kuwabara Y，et al.RNASEN regulates cell proliferation and affects survival in esophageal cancer patients〔J〕.Clin Cancer Res，2006;12:7322-8.