脈沖電磁場(chǎng)對(duì)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

李藝敏 陳 健(福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 35008)

脈沖電磁場(chǎng)(PEMFs)作為一種非創(chuàng)傷性的物理療法，對(duì)骨質(zhì)疏松有重要的治療作用。1978年Martin等〔1〕發(fā)現(xiàn)PEMFs對(duì)骨質(zhì)疏松的效應(yīng)。1989年Bassett〔2〕也提出PEMFs可能對(duì)骨質(zhì)疏松產(chǎn)生治療作用。在近年來(lái)的臨床研究中，PEMFs也被證實(shí)可有效提高骨質(zhì)疏松患者橈骨遠(yuǎn)端、脊柱以及膝部的骨礦密度〔3〕。PEMFs具有見效快、操作簡(jiǎn)便、適用范圍廣和無(wú)不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上(尤其是康復(fù)科)得到廣泛的應(yīng)用。近幾年P(guān)EMFs對(duì)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究逐漸增多，但是還有很多疑惑，其復(fù)雜的作用機(jī)制尚存爭(zhēng)議。本文就PEMFs對(duì)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的生物學(xué)影響和作用機(jī)制做一綜述，旨在為PEMFs預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的研究提供理論依據(jù)。

1 PEMFs對(duì)破骨細(xì)胞的生物學(xué)影響

1.1 對(duì)細(xì)胞數(shù)量和功能的影響 破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性直接關(guān)系到骨吸收的狀態(tài)，從而影響骨重建。白孟海等〔4，5〕的研究觀察到電磁場(chǎng)能降低去勢(shì)大鼠血清ALP水平和抑制骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞形成，使用頻率分別為1.5、2、75 Hz的PEMFs，1次/d，每次30 min，對(duì)培養(yǎng)的破骨細(xì)胞進(jìn)行治療2 w后觀察到大鼠骨髓體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞形成數(shù)量減少，頻率為2 Hz的效果最佳。Kyle等〔6〕在PEMFs刺激破骨細(xì)胞的形成研究中采用了 4.8、8.7、12.2 μV/cm 共 3 組磁感應(yīng)強(qiáng)度變化率，感應(yīng)電場(chǎng)強(qiáng)度為4.8和12.2 μV/cm時(shí)，破骨細(xì)胞的數(shù)量分別有明顯減少和增加。黃晶晶等〔7〕在PEMFs對(duì)大鼠破骨細(xì)胞功能分子的影響研究中發(fā)現(xiàn)，去卵巢大鼠活體在接受PEMFs作用后，應(yīng)用αβ、RANK、cathepsinK免疫熒光染色顯示 PEMFs組較對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)破骨細(xì)胞均明顯減少，說(shuō)明PEMFs對(duì)骨質(zhì)疏松時(shí)破骨細(xì)胞活性具有抑制作用。趙吉等〔8〕實(shí)驗(yàn)表明PEMFs對(duì)OC的分化和功能有抑制作用，可以抑制OC與骨吸收有關(guān)的生物活性。張小云等〔9〕的研究也證實(shí)PEMFs能夠抑制破骨細(xì)胞生長(zhǎng)和破骨功能，從而提高骨密度及骨強(qiáng)度，對(duì)于骨質(zhì)疏松有較好的干預(yù)效果。以上研究說(shuō)明了不同頻率的電磁場(chǎng)對(duì)破骨細(xì)胞數(shù)量和活性的調(diào)節(jié)作用，不同參數(shù)值的PEMFs對(duì)破骨細(xì)胞具有抑制和促進(jìn)雙重作用。至于PEMFs發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞效應(yīng)的最適頻率范圍是多少，尚無(wú)定論，有待進(jìn)一步研究。

1.2 對(duì)破骨細(xì)胞的作用機(jī)制探討

1.2.1 對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制研究 細(xì)胞凋亡又稱程序性死亡，是由于內(nèi)外環(huán)境激發(fā)所致細(xì)胞自身主動(dòng)、有序的死亡方式，其過(guò)程涉及精確的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。破骨細(xì)胞凋亡能夠間接促進(jìn)骨形成。Chang等〔10〕研究PEMFs對(duì)破骨細(xì)胞凋亡的影響中發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，包括染色質(zhì)凝聚和核裂解，且暴露PEMFs 8 h或16 h組后破骨細(xì)胞凋亡率增加，8 h組作用更明顯，說(shuō)明不同時(shí)長(zhǎng)的電磁場(chǎng)促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡的作用效果不同。謝肇等〔11〕觀察PEMFs對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞凋亡的影響，作者采用原位DNA末端標(biāo)記染色法(TUNEL法)和透射電鏡檢測(cè)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果表明PEMFs對(duì)OVX-OP大鼠成骨細(xì)胞凋亡具有抑制作用，而對(duì)破骨細(xì)胞凋亡則具有促進(jìn)作用。Brighton〔12〕推測(cè)電磁場(chǎng)刺激能通過(guò)細(xì)胞膜壓力依賴性鈣通道或者胞內(nèi)貯存池來(lái)提高細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度，改變膜電位，增強(qiáng)胞內(nèi)生物酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。以上研究局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、體外試驗(yàn)，目前關(guān)于電磁場(chǎng)對(duì)人體破骨細(xì)胞凋亡的臨床研究相對(duì)匱乏，須進(jìn)一步研究，以闡明其凋亡機(jī)制，為PEMFs的臨床應(yīng)用提供可靠依據(jù)。

1.2.2 RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)研究 RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與破骨細(xì)胞分化及活化過(guò)程密切相關(guān)的細(xì)胞因子。骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)是TNF受體超家族成員之一，TNF家族與破骨細(xì)胞的形成和凋亡息息相關(guān)。電磁場(chǎng)通過(guò)影響TNF家族調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，而后間接作用于OPG/RANKL/RANK通路，影響破骨細(xì)胞的形成。PEMFs對(duì)破骨細(xì)胞的確切作用機(jī)制仍不明確，文獻(xiàn)報(bào)道較少。Chen等〔13〕對(duì)去卵巢大鼠采用電磁場(chǎng)強(qiáng)度為3.8 mT，頻率為8 Hz的PEMFs，1 次/d，每次40 min，連續(xù)暴露30 d，結(jié)果表明 PEMFs可顯著增加去卵巢大鼠破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的碳酸酐酶Ⅱ和核因子κB受體活化因子的mRNA表達(dá)。核因子kB受體活化因子是破骨細(xì)胞上RANKL的惟一受體，其功能為傳遞RANKL信號(hào)，與促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、成熟及骨吸收功能有關(guān)〔14～16〕。碳酸酐酶Ⅱ可通過(guò)調(diào)節(jié)H+的分泌，通過(guò)影響破骨細(xì)胞的分化和移動(dòng)影響骨吸收的程度，說(shuō)明PEMFs可通過(guò)RANK和碳酸酐酶Ⅱ作用于破骨細(xì)胞。Barnaba等〔17〕分別使用相同強(qiáng)度的靜態(tài)電磁場(chǎng)和PEMFs對(duì)人類破骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第7、10、14天對(duì)破骨細(xì)胞形態(tài)及抗酒石酸酸性磷酸酶的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示PEMFs可影響培養(yǎng)第7天的破骨細(xì)胞表型，而其他試驗(yàn)結(jié)果陰性。因此，他們推斷PEMFs用于治療骨不連、骨質(zhì)疏松癥等疾病的機(jī)制在于其能夠促進(jìn)成骨過(guò)程，而不在于其對(duì)破骨過(guò)程的抑制作用。Zhou等〔18〕將場(chǎng)強(qiáng)為3.8 mT，頻率為8 Hz的PEMFs連續(xù)作用于去卵巢大鼠破骨細(xì)胞12 w，結(jié)果表明脈沖電磁場(chǎng)能夠增加細(xì)胞內(nèi)OPG蛋白的表達(dá)，抑制RANKL蛋白的表達(dá)，說(shuō)明電磁場(chǎng)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成和骨吸收，至少部分是通過(guò)OPG/RANKL/RANK介導(dǎo)的，但是OPG/RANKL/RANK通路可能并不是脈沖電磁場(chǎng)作用的惟一通路。電磁場(chǎng)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成和骨吸收是否通過(guò)其他信號(hào)通路的介導(dǎo)，尚不十分明確，有待進(jìn)一步研究。

2 PEMFs對(duì)成骨細(xì)胞的生物效應(yīng)

2.1 對(duì)細(xì)胞增殖和分化的影響 大量基礎(chǔ)研究表明，PEMFs能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，并且這種增殖作用存在一個(gè)“窗口”效應(yīng)，文獻(xiàn)中使用的PEMFs不盡相同，所以產(chǎn)生“窗口”效應(yīng)的場(chǎng)強(qiáng)、頻率也各不相同。俞索靜等〔19〕觀察PEMFs對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖影響的活細(xì)胞成像研究，通過(guò)活細(xì)胞成像技術(shù)證實(shí)，特定強(qiáng)度的PEMFs可以促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞增殖。于靈芝等〔20〕的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)頻率12 Hz、強(qiáng)度11 mT的PEMFs干預(yù)能明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。李飛江等〔21〕對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞行場(chǎng)強(qiáng)1 mT、頻率 15 Hz，占空比 10%、20%、40%、60%的 PEMFs作用，8 h/d，持續(xù)作用3 d，結(jié)果顯示所有占空比組均能提高大鼠成骨細(xì)胞的增殖和分化，40%和60%占空比組增殖作用效果最顯著，60%占空比組的分化效果最為明顯。證實(shí)了低強(qiáng)度PEMFs對(duì)新生大鼠成骨細(xì)胞的促增殖和分化作用，而且對(duì)成骨細(xì)胞的影響有可能存在“占空比”窗口。另外，也有實(shí)驗(yàn)研究表明，低強(qiáng)度PEMFs促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化的作用效果存在波形和作用時(shí)間的差異性〔22〕。以上研究表明，不同頻率、不同占空比的電磁場(chǎng)對(duì)成骨細(xì)胞的增殖具有正性刺激作用。

不同強(qiáng)度和頻率的電磁場(chǎng)對(duì)成骨細(xì)胞的分化能力的影響也不同。黃晶晶等〔23〕實(shí)驗(yàn)表明PEMFs作用成骨細(xì)胞可促進(jìn)成骨細(xì)胞功能分化，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)礦化。宋晉剛等〔24〕選用場(chǎng)強(qiáng) 1.1 mT，頻率分別為 5，25，50，75，100 和 150 Hz的PEMFs作用于MSCs，每日30 min，連續(xù)作用21 d，結(jié)果提示:不同頻率PEMFs作用組均能誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化;從5～50 Hz頻段，PEMFs的成骨誘導(dǎo)作用隨著頻率的增加而增強(qiáng);從50～150 Hz頻段，PEMFs的成骨誘導(dǎo)作用隨著頻率的增加而減弱，他們推測(cè)，頻率是PEMFs成骨誘導(dǎo)的重要影響因素之一，PEMFs的作用頻率不同，對(duì)細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)作用不一，50 Hz可能為誘導(dǎo)體外 MSCs向成骨細(xì)胞分化的適合頻率。Zhou等〔25〕發(fā)現(xiàn)頻率為50 Hz的正弦電磁場(chǎng)在 0.9 ～4.8 mT 之間，呈強(qiáng)度依賴性抑制成骨細(xì)胞增殖，但可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和礦化，在磁感應(yīng)強(qiáng)度1.8 mT and 3.6 mT時(shí)效果最佳。上述研究表明，低強(qiáng)度、低頻率的PEMFs對(duì)成骨細(xì)胞的分化和礦化均起作用，但最佳參數(shù)設(shè)置應(yīng)為多少，尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)，需深入研究。堿性磷酸酶作為成骨細(xì)胞成熟、分化早期標(biāo)志酶，參與骨基質(zhì)的分泌和成熟階段的調(diào)節(jié)，其表達(dá)隨著細(xì)胞分化、功能的活躍而增強(qiáng)，代表著細(xì)胞的活躍程度和骨形成的狀況。李志鋒等〔26〕對(duì) ROB 采用 50 Hz，0.14 mT、0.16 mT 和 0.18 mT 的PEMFs進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示0.14 mT的PEMFs對(duì)ROB增殖和分化均無(wú)明顯影響;0.16 mT、0.18 mT的 PEMFs可明顯提高ALP活性。說(shuō)明PEMFs可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，且這種作用存在較為敏感的“強(qiáng)度窗”效應(yīng)。Tsai等〔27〕使用 300 ms，頻率7.5 Hz的矩形方波刺激hMSCs，在試驗(yàn)后期階段，磁場(chǎng)組觀察到成骨細(xì)胞數(shù)目增多，并且成骨細(xì)胞早期表達(dá)基因Runx2/Cbfa1和ALP上調(diào)。

2.2 對(duì)細(xì)胞Ca2+的影響 鈣離子作為細(xì)胞信使，對(duì)細(xì)胞各項(xiàng)生理功能至關(guān)重要。當(dāng)成骨細(xì)胞內(nèi)的鈣離子升高，成骨代謝活動(dòng)就會(huì)增強(qiáng)。陳建庭等〔28〕在探討PEMFs對(duì)成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)體系中成骨細(xì)胞膜電位及細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)PEMFs作用于成骨細(xì)胞引致細(xì)胞出現(xiàn)去極化，從而開放電壓依賴型鈣離子通道，使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度升高，鈣離子作為細(xì)胞的第二信使，介導(dǎo)PMEF對(duì)成骨細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用。Zhang等〔29〕采用磁場(chǎng)強(qiáng)度0.8 mT、頻率50 Hz的極低頻PEMFs刺激大鼠成骨樣細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度發(fā)生改變，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了強(qiáng)度0.8 mT、頻率50 Hz的極低頻PEMFs能提高細(xì)胞內(nèi)游離鈣的攝取量，并首次描繪了EMF作用效果的量化地圖，對(duì)EMF的臨床應(yīng)用有很大參考價(jià)值。說(shuō)明PEMFs是通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子的移動(dòng)，促進(jìn)成骨細(xì)胞內(nèi)鈣離子的沉積而發(fā)揮成骨作用的。

2.3 對(duì)成骨細(xì)胞的作用機(jī)制初探 Bodamyali等〔30〕采用磁場(chǎng)強(qiáng)度1.8 mT、頻率15 Hz的鋸齒形電磁場(chǎng)作用于大鼠顱骨成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量和大小比對(duì)照組分別增加了30%和70%，細(xì)胞表達(dá)的BMP-2 mRNA和BMP-4 mRNA也增加，而且這種效應(yīng)與暴露時(shí)間直接相關(guān)。Sollazzo等〔31〕證實(shí)了PEMF可促進(jìn)成骨細(xì)胞合成Ⅰ型膠原，并認(rèn)為PEMF在促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63增殖時(shí)上調(diào)了成骨相關(guān)基因(HOXA10、AKT1)的表達(dá)。在針對(duì)PEMFs作用機(jī)制的研究中，Cheng等〔32〕采用頻率為50 Hz，強(qiáng)度為1.8 mT的正弦電磁場(chǎng)作用于大鼠成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SEMF暴露組一氧化氮合酶(NOS)、鳥甘酸環(huán)化酶(sGC)、蛋白激酶G(PKG)的蛋白含量較其他試驗(yàn)組明顯上調(diào)，他們推斷正弦電磁場(chǎng)能激活NO-cGMP-PKG信號(hào)途徑，阻斷此信號(hào)途徑，正弦電磁場(chǎng)刺激成骨細(xì)胞分化和礦化的作用也隨之衰減。Jansen等〔33〕對(duì)成骨細(xì)胞施加 PEMFs刺激，持續(xù) 9 d，PEMFs治療組的成骨細(xì)胞的BMP-2 mRNA和TGF-β1水平明顯升高。這些研究部分地揭示了PEMFs作用于成骨細(xì)胞的潛在機(jī)制。

3 小結(jié)

上述大量研究從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和離體細(xì)胞培養(yǎng)表明，PEMFs對(duì)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞均有生物學(xué)影響，但是PEMFs發(fā)揮生物效應(yīng)的最佳參數(shù)設(shè)置，最適場(chǎng)強(qiáng)、頻率、作用時(shí)間等尚無(wú)定論，作用于破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制也有待進(jìn)一步闡明。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，其復(fù)雜的作用機(jī)制將逐步明確。有資料顯示，骨質(zhì)疏松癥和骨免疫細(xì)胞也有關(guān)聯(lián)，而PEMFs對(duì)此類細(xì)胞的研究幾乎是空白，可加強(qiáng)這個(gè)領(lǐng)域的研究工作，以便為PEMFs的臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

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