轉(zhuǎn)細(xì)胞色素P450酶人源化小鼠及應(yīng)用的研究進(jìn)展

程一帆，馬 璟，嚴(yán)東明

(中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海 201203)

細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP)是肝微粒體中存在的一種與CO結(jié)合并在450 nm處存在最大吸收的色素［1］。目前發(fā)現(xiàn)的CYP超過(guò)500種，共有57個(gè)同工酶分屬于18個(gè)家族和43個(gè)亞家族，它們參與介導(dǎo)了體內(nèi)大部分化合物的代謝過(guò)程［2－4］。在新藥研發(fā)過(guò)程中必須在臨床前進(jìn)行大量的動(dòng)物藥效、藥代和毒理學(xué)研究，但由于CYP酶的種屬間差異性，導(dǎo)致動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)外推至人存在不確定性。近年來(lái)，利用基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)設(shè)計(jì)出的轉(zhuǎn)人CYP的人源化小鼠模型為藥物的研發(fā)提供了極大的便利，轉(zhuǎn)CYP人源化小鼠(CYP humanized mouse)是將人CYP相關(guān)基因或者人外源性激活的核受體直接導(dǎo)入或者替代小鼠相關(guān)等位基因，制備出可以表達(dá)人CYP的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。本文綜述了轉(zhuǎn)CYP人源化小鼠及應(yīng)用的研究進(jìn)展。

1 傳統(tǒng)模型及轉(zhuǎn)CYP人源化小鼠模型的優(yōu)勢(shì)

CYP酶系，尤其是CYP1-3家族參與了超過(guò)75%的臨床用藥、前致癌物的I相代謝反應(yīng)以及大量日常膳食和外源化合物的生物轉(zhuǎn)化調(diào)控［5－7］。近期對(duì)CYP一些酶結(jié)構(gòu)和功能的研究報(bào)道，發(fā)現(xiàn)酶上特定結(jié)構(gòu)位點(diǎn)能與某些環(huán)境因子、污染物產(chǎn)生較強(qiáng)的結(jié)合，促進(jìn)了外源化合物的體內(nèi)轉(zhuǎn)化［8］。因此，針對(duì)CYP的研究，對(duì)研究化學(xué)物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化和體內(nèi)毒性有著極其重要的臨床意義和科研價(jià)值。

目前研究藥物代謝的體外模型有肝微粒體模型、基因重組酶系模型、肝細(xì)胞模型、肝-腸灌流模型和肝組織切片模型等。對(duì)于體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化率低、毒性大及缺乏靈敏檢測(cè)手段的藥物來(lái)說(shuō)，體外代謝研究已成為良好的研究手段。但是體外實(shí)驗(yàn)脫離體內(nèi)微環(huán)境的支持，并且模型在構(gòu)建時(shí)難免會(huì)破壞細(xì)胞、器官、組織的完整結(jié)構(gòu)或者使某些蛋白丟失，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)真實(shí)代謝情況具有差異性。此外，體外模型也不方便進(jìn)行多個(gè)代謝產(chǎn)物的同時(shí)分析［9］。

為了模擬生物體的整體效果，一般還需要進(jìn)行體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)。相較于體外實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)具有一定的難度。但是體內(nèi)代謝模型可以綜合考慮各種體內(nèi)因素對(duì)藥物的影響，能夠真實(shí)全面地反映藥物代謝的體內(nèi)整體特征。嚙齒類動(dòng)物已成為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的較優(yōu)選擇［10－12］。然而，一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)CYP酶系的催化活性與人相比有顯著的差異性，因此特定化合物的代謝與人不同。以人CYP2D6和鼠Cyp2d亞家族以及人CYP3A4和鼠Cyp3a亞家族的活性差異尤為顯著。大、小鼠和人CYP酶在基因復(fù)雜性，基因拷貝量以及它們?cè)诮M織中的表達(dá)分布等多方面有種屬差異性［13］。Krausova等［14］研究表明，對(duì)于調(diào)控CYP基因表達(dá)的特定核受體也存在著種屬差異，這也是導(dǎo)致大、小鼠和人對(duì)外源性物質(zhì)代謝調(diào)控差異性的重要原因。因此，采用普通大、小鼠模型預(yù)測(cè)外源性物質(zhì)(如藥物)在人體內(nèi)代謝和相互作用的結(jié)果并不理想。

隨著基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，以及日漸成熟的轉(zhuǎn)基因和基因融合技術(shù)，人們已可以培育出帶有靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，在小鼠上表達(dá)人類基因，就構(gòu)建出了人源化小鼠模型(humanized mouse model)。人源化小鼠模型通常帶有功能性的人類基因、細(xì)胞或組織，因此可以模擬人體內(nèi)環(huán)境。通過(guò)構(gòu)建人源化小鼠模型可以解決動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)外推至人體時(shí)的不確定性問(wèn)題。近些年來(lái)，人源化小鼠模型逐漸被用做人類疾病研究穩(wěn)定的活體替代模型，有些品系已經(jīng)應(yīng)用多年，且沒(méi)有出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因缺失的現(xiàn)象，因而成為研究化合物在人體內(nèi)作用規(guī)律的重要工具。人源化小鼠模型在研究CYP的內(nèi)源性底物、尋找核受體的配體、藥物作用新靶點(diǎn)及疾病相關(guān)蛋白［15］以及確定酶和核受體介導(dǎo)的生理藥理過(guò)程等方面也有重要的應(yīng)用。

2 人源化小鼠模型的研究進(jìn)展

1974年Jaenisch等［16］首次報(bào)道，通過(guò)向小鼠囊胚注入猴(simian)病毒40(SV40)后，40%子代小鼠體內(nèi)檢測(cè)到SV40的表達(dá)產(chǎn)物，證明了外源DNA整合入胚胎細(xì)胞中的可能性。1980年Gordon等［17］通過(guò)原核期胚胎顯微注射方法制備出了轉(zhuǎn)基因小鼠，開(kāi)辟了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究領(lǐng)域的新紀(jì)元。1982年P(guān)almiter等［18］報(bào)道，將5'調(diào)控區(qū)缺失后的大鼠生長(zhǎng)激素基因與小鼠金屬硫蛋白I基因啟動(dòng)子相連接，培育出“巨型小鼠”，在生命科學(xué)領(lǐng)域引起了一場(chǎng)不小的轟動(dòng)。1985年Smithies等［19］首次證實(shí)了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同源重組的存在，奠定了基因敲除的理論基礎(chǔ)。1987年Thomas等［20］根據(jù)同源重組原理，實(shí)現(xiàn)了ES細(xì)胞引入外源基因的定點(diǎn)整合，這一技術(shù)稱為“基因打靶”(gene targeting)。基因打靶技術(shù)的問(wèn)世大大提高了構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功率和準(zhǔn)確率。1993年，Gu等［21］應(yīng)用Cre/loxP重組酶轉(zhuǎn)染技術(shù)實(shí)現(xiàn)了外源基因的條件性表達(dá)規(guī)避了基因打靶可能會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡的一些不足。目前在轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方面比較常用的方法依舊是基因打靶以及利用重組酶轉(zhuǎn)染技術(shù)的條件性打靶方式或者基于二者為基礎(chǔ)的一些新技術(shù)。

轉(zhuǎn)人基因小鼠模型在諸多領(lǐng)域均有應(yīng)用，其中在研究CYP功能調(diào)控，進(jìn)一步揭示藥物代謝毒性反應(yīng)等方面近15年來(lái)也取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。2001年Corchero等［22］成功制備了表達(dá)人類CYP2D6的轉(zhuǎn)基因小鼠模型用于藥理和毒理的臨床前研究，成功解決了由于異喹胍羥化酶(CYP2D6)種屬間顯著差異所引起的其他動(dòng)物模型用于毒理評(píng)價(jià)的缺陷。2003年，Granvil等［23］將包含人 CYP3A4和 CYP3A7基因的BAC(細(xì)菌人工染色體)注入敲除掉等位基因的小鼠體內(nèi)，制備了人源化轉(zhuǎn)基因小鼠模型。2005年，Cheung等［24］用同原理的方法制備了CYP2E1人源化小鼠研究了對(duì)乙酰氨基酚的肝毒性。2008年，F(xiàn)elmlee等［25］通過(guò)將分別攜有CYP2D6和CYP3A4的小鼠進(jìn)行交配，成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)CYP3A4/CYP2D6的雙轉(zhuǎn)基因小鼠，并研究發(fā)現(xiàn)在不同發(fā)育階段和不同性別的個(gè)體中CYP會(huì)受到多種多樣的外源性因素影響。綜上所述，克服了種屬間差異性的人源化小鼠模型是研究CYP的功能和藥物在人體內(nèi)代謝規(guī)律的最優(yōu)選擇。

3 轉(zhuǎn)CYP人源化小鼠的分類

轉(zhuǎn)人CYP人源化小鼠根據(jù)轉(zhuǎn)入酶的不同進(jìn)行分類，目前主要有轉(zhuǎn)人CYP1A亞家族、CYP2D6、CYP3A亞家族、孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)/CYP3A4，CYP4F2和CYP2E1等人源化小鼠模型。

3.1 轉(zhuǎn)CYP1A亞家族人源化小鼠

CYP1A亞家族包含了CYP1A1和CYP1A2兩種酶。外源性物質(zhì)經(jīng)CYP1A代謝產(chǎn)物包括多環(huán)芳香族碳?xì)浠衔?PAH)、雜環(huán)胺和雜環(huán)芳香胺等多種化學(xué)致癌物［26］。

利用BAC技術(shù)將編碼人CYP1A1和CYP1A2的基因轉(zhuǎn)入鼠源CYP1A1和CYP1A2敲除的小鼠中，形成相應(yīng)的人源化小鼠。通過(guò)對(duì)CYP1A的mRNA拷貝數(shù)、蛋白表達(dá)水平以及相關(guān)酶活性等參數(shù)的檢測(cè)結(jié)果顯示，人源化小鼠肝內(nèi)CYP1A1和CYP1A2表達(dá)情況與人體內(nèi)表達(dá)情況類似。對(duì)人源化小鼠和野生型小鼠給予CYP1A1特異性底物〔苯并(a)芘和乙氧基試鹵靈〕和CYP1A2特異性底物(乙酰苯胺和甲氧基異酚二唑)代謝后檢測(cè)得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人源化小鼠肝內(nèi)的CYP1A1催化苯并(a)芘的羥化效率比野生鼠源CYP1a1的催化效率低97.4%到99.4%，且7-乙氧基異吩噁唑酮脫乙基酶活性也低約98.1%。與此不同的是，兩者表達(dá)的CYP1A2的功能幾乎相同。綜上所述，鼠和人的CYP1A底物特異性變化比較大且這些變化與CYP1A的表達(dá)水平或蛋白濃度無(wú)關(guān)，但只要注意這些變化，轉(zhuǎn)CYP1A人源化小鼠依舊可以作為安全性評(píng)價(jià)、毒理學(xué)、藥理學(xué)和一些疾病治療的有效工具［27－28］。

3.2 轉(zhuǎn)CYP2D6人源化小鼠

人CYP2D6酶參與了超過(guò)25%市售藥物的體內(nèi)代謝。然而CYP2D6酶的種屬差異性比較大，大鼠和小鼠至少含有5種CYP2D基因，但無(wú)一能編碼與人相同的CYP2D6活性。因此，缺乏動(dòng)物模型研究CYP2D6多態(tài)性，而人源化CYP2D6小鼠模型可對(duì)弱、強(qiáng)代謝型不同表型的研究提供手段。這使得應(yīng)用普通動(dòng)物模型很難預(yù)測(cè)CYP2D6介導(dǎo)的藥物代謝［29－31］。

在人源化CYP2D6(humanized CYP2D6，hCYP2D6)小鼠，野生型小鼠和CYP2D敲除小鼠中通過(guò)Western蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在hCYP2D6小鼠體內(nèi)CYP2D6在肝，十二指腸和空腸均大量表達(dá);回腸微粒體檢測(cè)結(jié)果表明，相較于小腸的其他部位其CYP2D6的表達(dá)略微降低。此外，在腎微粒體中也檢測(cè)出了CYP2D6的表達(dá)。而在野生型小鼠和CYP2D敲除小鼠提取的組織微粒體中均無(wú)法檢測(cè)出CYP2D6的表達(dá)。與之相反的是相應(yīng)的鼠源CYP2D基因表達(dá)產(chǎn)物在野生型小鼠體內(nèi)大量表達(dá)而在hCYP2D6和CYP2D敲除小鼠表達(dá)甚少。野生型和hCYP2D6小鼠體內(nèi)CYP2D6底物的藥代學(xué)研究中，分別檢測(cè)野生型和hCYP2D6小鼠在給予奎尼丁前后丁呋洛爾的代謝變化和異喹胍在兩者體內(nèi)的代謝情況。結(jié)果顯示，野生型小鼠體內(nèi)丁呋洛爾的消除較快，這與其1'-羥化酶活性較高的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。聯(lián)合給予奎尼丁后，hCYP2D6體內(nèi)丁呋洛爾暴露量增加，而野生型小鼠體內(nèi)無(wú)明顯變化，這與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，驗(yàn)證了奎尼丁是人CYP2D6的選擇性抑制劑。野生型小鼠與hCYP2D6小鼠體內(nèi)異喹胍代謝實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，野生型小鼠體內(nèi)異喹胍的暴露量很高，這與hCYP2D6小鼠體內(nèi) 4'-羥化酶活性較高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因此，轉(zhuǎn)CYP2D6人源化小鼠是檢測(cè)CYP2D6選擇性抑制劑和特異性底物的良好工具［29］。應(yīng)用該人源化小鼠模型對(duì)于揭示該酶介導(dǎo)的體內(nèi)藥物代謝和藥物相互作用中個(gè)體差異的原因，及在新藥研發(fā)和毒性評(píng)價(jià)等方面均具有重要的價(jià)值。

3.3 轉(zhuǎn)CYP3A亞家族人源化小鼠

人類第7號(hào)染色體上有編碼CYP3A家族的基因，CYP3A亞家族包含了4個(gè)同源基因(CYP3A4，CYP3A5，CYP3A7和CYP3A43)。小鼠CYP3A亞家族包含了7個(gè)編碼基因，但是與人的編碼基因并沒(méi)有同源性。說(shuō)明人的CYP3A中的各個(gè)同工酶來(lái)自于同一祖先。通過(guò)最新的質(zhì)譜陽(yáng) 離 子 檢 測(cè) 發(fā) 現(xiàn)［32］，CYP3A4，CYP3A5，CYP3A7 和CYP3A43結(jié)構(gòu)相同的部分達(dá)到85.4%。CYP3A4是P450酶系中在小腸中表達(dá)的主要代謝酶，參與了眾多口服藥物的首過(guò)代謝，其表達(dá)水平與在肝臟中表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性。人CYP3A4與小鼠CYP3A家族之間存在著顯著的種屬差異性，普通小鼠不能很好的預(yù)測(cè)由CYP3A4介導(dǎo)的藥物代謝。

Granvil等［23］利用 BAC克隆技術(shù)，將一個(gè)上游帶有PXR-位點(diǎn)的全人CYP3A4基因?qū)氲叫∈篌w內(nèi)表達(dá)，生成人源化小鼠。檢測(cè)小鼠的腸微粒體發(fā)現(xiàn)，人源化小鼠小腸較野生型小鼠高度表達(dá)CYP3A4?？诜o予CYP3A4探針?biāo)庍溥_(dá)唑侖，顯示人源化CYP3A4小鼠對(duì)其的代謝清除率遠(yuǎn)高于無(wú)CYP3A4的野生型小鼠，而靜脈注射給予此藥在小腸內(nèi)代謝清除率無(wú)明顯差異。同時(shí)口服給予CYP3A4抑制劑酮康唑，發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖的清除率降低，驗(yàn)證了咪達(dá)唑侖和酮康唑間潛在的藥物相互作用。van Waterschoot等［33］設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)將人CYP3A4基因轉(zhuǎn)入CYP3A敲除的小鼠生成轉(zhuǎn)CYP3A4人源化小鼠，應(yīng)用三唑侖作為探針?biāo)庍M(jìn)行檢測(cè)。與結(jié)構(gòu)類似物咪達(dá)唑侖相比，三唑侖較其他鼠源CYP酶來(lái)說(shuō)是更好的CYP3A特異性底物。通過(guò)檢測(cè)小鼠體內(nèi)三唑侖代謝產(chǎn)物1'-OH-三唑侖和4-OH-三唑侖的濃度來(lái)評(píng)估野生型小鼠、CYP3A敲除［CYP3A(－/－)］小鼠、轉(zhuǎn)人 CYP3A4基因(CYP3A4-Tg)小鼠體內(nèi)代謝活性情況。提取相應(yīng)的小鼠肝微粒體進(jìn)行檢測(cè)，野生型小鼠微粒體中檢測(cè)出三唑侖代謝產(chǎn)物為1'-OH和4-OH三唑侖，其代謝反應(yīng)符合米氏動(dòng)力學(xué)。三唑侖低濃度時(shí)，主要產(chǎn)物為1'-OH三唑侖，隨著三唑侖濃度升高，主要代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)為4-OH三唑侖。在CYP3A(－/－)小鼠肝微粒體中檢測(cè)結(jié)果顯示，三唑侖的代謝程度大大降低，幾乎無(wú)法代謝。與野生型小鼠相比1'-OH三唑侖濃度降低了97.5%而4-OH三唑侖濃度降低92.8%。在CYP3A4-Tg小鼠體內(nèi)，僅在肝組織處表達(dá)CYP3A4，與野生型相比展現(xiàn)出不同的藥代動(dòng)力學(xué)輪廓。CYP3A4與三唑侖的親和力比鼠CYP3A的小80.0%，但其代謝三唑侖產(chǎn)生1'-OH三唑侖的最大反應(yīng)速率與鼠源CYP3A相比提高了3倍。因此，在CYP3A4-Tg小鼠中生成1'-OH-三唑侖的固有清除率與WT小鼠相比僅降低了38.3%，而生成4-OH-三唑侖代謝反應(yīng)的固有清除率還增加了2.1倍。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與人肝微粒體體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果很相似，且藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)也處于同一水平［33］。

綜上所述，利用轉(zhuǎn)人CYP3A4人源化小鼠研究CYP3A4介導(dǎo)的藥物代謝，可以得到與人體代謝相似的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為研究藥物在體內(nèi)的代謝，評(píng)估藥物間的相互作用，預(yù)測(cè)藥物的潛在危險(xiǎn)提供了寶貴的方法。

3.4 轉(zhuǎn)PXR/CYP3A4雙轉(zhuǎn)基因人源化小鼠

核受體PXR和構(gòu)雄烷受體(contitutive androstane receptor，CAR)由DNA結(jié)合域和配體結(jié)合域組成，其配體結(jié)合域可以與眾多藥物配體(如巴比妥類、利福平、他汀類藥物、鈣拮抗劑、咪達(dá)唑侖)相結(jié)合。經(jīng)配體活化的PXR發(fā)生構(gòu)象改變后，作用于CYP3A4基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA應(yīng)答元件誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)［34－36］。PXR與不同配體的親和力具有種屬差異性。例如利福平作為典型的PXR配體而不能活化大鼠PXR。這種種屬差異限制了動(dòng)物模型在藥物代謝研究領(lǐng)域的應(yīng)用。構(gòu)建PXR-CYP3A4的人源化小鼠可以使得更多藥物在動(dòng)物體內(nèi)的代謝測(cè)試更準(zhǔn)確，促進(jìn)藥物臨床前安全性預(yù)測(cè)［37］。

MA等［38］設(shè)計(jì)出一種雙轉(zhuǎn)基因人源化小鼠(TgCYP3A4/hPXR)。用這種雙轉(zhuǎn)基因的小鼠模型進(jìn)行研究，使得人體內(nèi)PXR-CYP3A4介導(dǎo)的利福平-蛋白酶抑制劑間的相互作用得以重現(xiàn)，利福平預(yù)處理的TgCYP3A4/hPXR小鼠的肝微粒體中，安普那韋，奈非那韋和沙奎那韋的代謝穩(wěn)定性分別下降了52%，53%和99%。經(jīng)利福平預(yù)處理的小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清安普那韋的藥時(shí)曲線下面積降低80%［38］。這些結(jié)果表明，這種雙轉(zhuǎn)基因小鼠可以用于體內(nèi)CYP3A4轉(zhuǎn)錄和功能表達(dá)的研究。

PXR/CYP3A4人源化小鼠有著轉(zhuǎn)人PXR或轉(zhuǎn)人CYP3A4小鼠無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，其在藥代動(dòng)力學(xué)、檢測(cè)PXR激動(dòng)劑和抑制劑、在抑制炎癥和對(duì)人類疾病的調(diào)控等研究領(lǐng)域中的應(yīng)用取得了良好的效果［39］。

3.5 其他人源化小鼠

CYP4F2，CYP4A11和CYP4F3B被認(rèn)為是代謝花生四烯酸的主要酶類?；ㄉ南┧峥梢员画h(huán)氧合酶以及脂氧合酶分解成前列腺素，前列環(huán)素，血栓素以及白三烯類，對(duì)心血管疾病的防治有著重要的作用。有報(bào)道稱，轉(zhuǎn)CYP4F2基因在外源啟動(dòng)子的激動(dòng)下，可以增加花生四烯酸的含量［40］。劉曉亮等［41］將 pKAP-CYP4F2利用顯微注射技術(shù)導(dǎo)入FVB/N小鼠產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。通過(guò)Western蛋白質(zhì)印跡法，在所有腎部樣品中檢測(cè)出CYP4F2的表達(dá)，從而驗(yàn)證了轉(zhuǎn)CYP4F2小鼠模型的成功構(gòu)建。對(duì)人源化小鼠體內(nèi)花生四烯酸進(jìn)行研究表明其與體內(nèi)高血壓的形成有關(guān)。過(guò)量表達(dá)CYP4F2可以造成花生四烯酸產(chǎn)量增加從而促進(jìn)高血壓的生成，因此，轉(zhuǎn)CYP4F2小鼠模型的構(gòu)建對(duì)于研究高血壓的形成和治療將會(huì)很有意義。

Lu等［42］設(shè)計(jì)應(yīng)用野生型小鼠、CYP2E1敲除小鼠以及轉(zhuǎn)CYP2E1人源化小鼠研究乙醇誘發(fā)的肝損傷。在給予高濃度乙醇飼料連續(xù)飼養(yǎng)之后，他們發(fā)現(xiàn)脂肪肝和氧化應(yīng)激反應(yīng)存在于野生型小鼠和人源化CYP2E1小鼠中并且在人源化小鼠中肝損傷更為顯著。CYP2E1敲除小鼠體內(nèi)這些現(xiàn)象減弱。利用這種模型，可以揭示過(guò)度飲酒造成的損害，進(jìn)一步揭示乙醇對(duì)肝損傷的機(jī)制。

4 展望

轉(zhuǎn)CYP人源化小鼠模型的研究目前主要集中在構(gòu)建轉(zhuǎn)CYP1～3家族的人源化小鼠。利用這些模型進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)和藥物安全性評(píng)價(jià)可以得到比普通小鼠更真實(shí)可靠的外推數(shù)據(jù)。近些年國(guó)內(nèi)外已有公司構(gòu)建了人源化CYP2D6小鼠模型、人源化 CYP3A4/3A7小鼠模型、人源化 Liver CYP3A4小鼠模型和人源化PXR-CAR-CYP3A4/CYP3A7小鼠模型等產(chǎn)品進(jìn)入商業(yè)市場(chǎng)。這些商業(yè)化供應(yīng)的人源化小鼠廣泛應(yīng)用于體內(nèi)代謝酶的作用機(jī)制研究和新藥研發(fā)的相關(guān)過(guò)程。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的深入研究，一些實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了新靶點(diǎn)的CYP人源化小鼠，用來(lái)研究代謝酶參與的癌癥發(fā)病機(jī)制和外源化合物引起的毒性反應(yīng)。這些將為探索生命科學(xué)的奧秘、揭示疾病和健康的關(guān)系提供強(qiáng)有力的支持。

［1］David F.V.Lewis.Cytochromes P450:structure，function and mechanism［M］.Taylor＆ Francis，1996:1.

［2］Nelson D.Cytochrome P450s in humans［J］.Last modified，2003，［EB/OL］http:∥www.bolstad.dk/cytochrome%20p450s%20in%20humans1999.doc

［3］Ooi JP，Kuroyanagi M，Sulaiman SF，Muhammad TS，Tan ML.Andrographolide and 14-deoxy-11，12-didehydroandrographolide inhibit cytochrome P450s in HepG2 hepatoma cells［J］.Life Sci，2011，88(9-10):447-454.

［4］Nelson DR，Koymans L，Kamataki T，Stegeman JJ，F(xiàn)eyereisen R，Waxman DJ，et al.P450 superfamily:update on new sequences，gene mapping，accession numbers and nomenclature［J］.Pharmacogenetics，1996，6(1):1-42.

［5］Danielson PB. ThecytochromeP450 superfamily:biochemistry，evolution and drug metabolism in humans［J］.Curr Drug Metab，2002，3(6):561-597.

［6］Ingelman-Sundberg M.Human drug metabolising cytochrome P450 enzymes:properties and polymorphisms［J］.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2004，369(1):89-104.

［7］Goh IX，How CH，Tavintharan S.Cytochrome P450 drug interactions with statin therapy［J］.Singapore Med J，2013，54(3):131-135.

［8］Williams PA，Cosme J，Vinkovic DM，Ward A，Angove HC，Day PJ，et al.Crystal structures of human cytochrome P450 3A4 bound to metyrapone and progesterone［J］.Science，2004，305(5684):683-686.

［9］Chen H，Wang L，Zhang W.Progress of liver metabolism in vitro［J］.Health Vocational Education，2009，27(21):138-140.

［10］Caumo A，Luzi L.Introduction to the tracer-based study of metabolism in vivo［M］∥Cellular Physiology and Metabolism of Physical Exercise.Milan:Springer Milan.2012:85－97.

［11］Chai SW，Pan GX.Brief description of drug metabolism research［J］.Tianjin J Tradit Chin Med(天津中醫(yī)藥)，2006，23(1):83-85.

［12］Laible G， Fahrenkrug SC. UC Davis transgenic animal research conference Ⅷ［J］.Transgenic Res，2012，21(6):1375-1376.

［13］Gonzalez FJ，Yu AM.Cytochrome P450 and xenobiotic receptor humanized mice［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2006，46:41-64.

［14］Krausova L，Stejskalova L，Wang H，Vrzal R，Dvorak Z，Mani S，et al.Metformin suppresses pregnane X receptor(PXR)-regulated transactivation of CYP3A4 gene［J］.Biochem Pharmacol，2011，82(11):1771-1780.

［15］Turner M.Mice with human livers deal with drugs the human way［J］.Nature，2011.［EB/OL］http:∥www.nature.com/news/2011/110711/full/news.2011.409.html.

［16］Jaenisch R，Mintz B.Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1974，71(4):1250-1254.

［17］Gordon JW，Scangos GA，Plotkin DJ，Barbosa JA，Ruddle FH.Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1980，77(12):7380-7384.

［18］Palmiter RD，Norstedt G，Gelinas RE，Hammer RE，Brinster RL.Metallothionein-human GH fusion genes stimulate growth of mice［J］.Science，1983，222(4625):809-814.

［19］Smithies O，Gregg RG，Boggs SS，Koralewski MA，Kucherlapati RS.Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination［J］.Nature，1985，317(6034):230-234.

［20］Thomas KR，Capecchi MR.Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells［J］.Cell，1987，51(3):503-512.

［21］Gu H，Zou YR，Rajewsky K.Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced through Cre-loxP-mediated gene targeting［J］.Cell，1993，73(6):1155-1164.

［22］Corchero J，Granvil CP，Akiyama TE，Hayhurst GP，Pimprale S，F(xiàn)eigenbaum L，et al.The CYP2D6 humanized mouse:effect of the human CYP2D6 transgene and HNF4alpha on the disposition of debrisoquine in the mouse［J］.Mol Pharmacol，2001，60(6):1260-1267.

［23］Granvil CP，Yu AM，Elizondo G，Akiyama TE，Cheung C，F(xiàn)eigenbaum L，et al.Expression of the human CYP3A4 gene in the small intestine of transgenic mice:in vitro metabolism and pharmacokinetics of midazolam［J］.Drug Metab Dispos，2003，31(5):548-558.

［24］Cheung C，Yu AM，Ward JM，Krausz KW，Akiyama TE，F(xiàn)eigenbaum L，et al.The cyp2e1-humanized transgenic mouse:role of cyp2e1 in acetaminophen hepatotoxicity［J］.Drug Metab Dispos，2005，33(3):449-457.

［25］Felmlee MA，Lon HK，Gonzalez FJ，Yu AM.Cytochrome P450 expression and regulation in CYP3A4/CYP2D6 double transgenic humanized mice［J］.Drug Metab Dispos，2008，36(2):435-441.

［26］Boverhof DR，Chamberlain MP，Elcombe CR，Gonzalez FJ，Heflich RH，Hernández LG，et al.Transgenic animal models in toxicology:historical perspectives and future outlook［J］.Toxicol Sci，2011，121(2):207-233.

［27］Uno S，Endo K，Ishida Y，Tateno C，Makishima M，Yoshizato K，et al.CYP1A1 and CYP1A2 expression:comparing ″humanized″mouse lines and wild-type mice;comparing human and mouse hepatoma-derived cell lines［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2009，237(1):119-126.

［28］Roymans D，Van Looveren C，Leone A，Parker JB，McMillian M，Johnson MD，et al.Determination of cytochrome P450 1A2 and cytochrome P450 3A4 induction in cryopreserved human hepatocytes［J］.Biochem Pharmacol，2004，67(3):427-437.

［29］Scheer N，Kapelyukh Y，McEwan J，Beuger V，Stanley LA，Rode A，et al.Modeling human cytochrome P450 2D6 metabolism and drug-drug interaction by a novel panel of knockout and humanized mouse lines［J］.Mol Pharmacol，2012，81(1):63-72.

［30］Winter JC，Amorosi DJ，Rice KC，Cheng K，Yu AM.Stimulus controlby 5-methoxy-N，N-dimethyltryptamine in wild-type and CYP2D6-humanized mice［J］.Pharmacol Biochem Behav，2011，99(3):311-315.

［31］Katoh M，Sawada T，Soeno Y，Nakajima M，Tateno C，Yoshizato K，et al.In vivo drug metabolism model for human cytochrome P450 enzyme using chimeric mice with humanized liver［J］.J Pharm Sci，2007，96(2):428-437.

［32］Ohtsuki S，Schaefer O，Kawakami H，Inoue T，Liehner S，Saito A，et al.Simultaneous absolute protein quantification of transporters，cytochromes P450，and UDP-glucuronosyltransferases as a novel approach for the characterization of individual human liver:comparison with mRNA levels and activities［J］.Drug Metab Dispos，2012，40(1):83-92.

［33］van Waterschoot RA， Rooswinkel RW， Sparidans RW，van Herwaarden AE，Beijnen JH，Schinkel AH.Inhibition and stimulation of intestinal and hepatic CYP3A activity:studies in humanized CYP3A4 transgenic mice using triazolam［J］.Drug Metab Dispos，2009，37(12):2305-2313.

［34］Zanger UM，Schwab M.Cytochrome P450 enzymes in drug metabolism:regulation of gene expression，enzyme activities，and impact of genetic variation［J］.Pharmacol Ther，2013，138(1):103-141.

［35］Yamamoto T，Kubota T，Ozeki T，Sawada M，Yokota S，Yamada Y，et al.Effects of the CYP3A5 genetic polymorphism on the pharmacokinetics of diltiazem［J］.Clin Chim Acta，2005，362(1-2):147-154.

［36］Cheung C，Yu AM，Chen CS，Krausz KW，Byrd LG，F(xiàn)eigenbaum L，et al.Growth hormone determines sexual dimorphism of hepatic cytochrome P450 3A4 expression in transgenic mice［J］.J Pharmacol Exp Ther，2006，316(3):1328-1334.

［37］Hasegawa M，Kapelyukh Y，Tahara H，Seibler J，Rode A，Krueger S，et al.Quantitative prediction of human pregnane X receptor and cytochrome P450 3A4 mediated drug-drug interaction in a novel multiple humanized mouse line［J］.Mol Pharmacol，2011，80(3):518-528.

［38］Ma X，Cheung C，Krausz KW，Shah YM，Wang T，Idle JR，et al.A double transgenic mouse model expressing human pregnane X receptor and cytochrome P450 3A4［J］.Drug Metab Dispos，2008，36(12):2506-2512.

［39］Cheng J，Ma X，Gonzalez FJ.Pregnane X receptor-and CYP3A4-humanized mouse models and their applications［J］.Br J Pharmacol，2011，163(3):461-468.

［40］Cai Y. Arachidonicacid cytochrome P450 4F2 in hypertension:what can we learn from a transgenic mouse model?［J］.Kidney Int，2009，75(12):1253-1254.

［41］Liu X，Zhao Y，Wang L，Yang X，Zheng Z，Zhang Y，et al.Overexpression of cytochrome P450 4F2 in mice increases 20-hydroxyeicosatetraenoic acid production and arterial blood pressure［J］.Kidney Int，2009，75(12):1288-1296.

［42］Lu Y，Wu D，Wang X，Ward SC，Cederbaum AI.Chronic alcoholinduced liver injury and oxidant stress are decreased in cytochrome P4502E1 knockout mice and restored in humanized cytochrome P4502E1 knock-in mice［J］.Free Radic Biol Med，2010，49(9):1406-1416.