蚊蟲Wolbachia野外試驗的研究進展

張東京，梁格豪，鄭展圖，劉秀婷，何石萍，葉慧珍，李卓雅，詹希美，鄭小英

2.中山大學中山醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，廣州 510080

登革熱（Dengue Fever，DF）主要是人由于感染登革病毒（Dengue Virus，DENV）而引起的一種蚊媒傳染病，該病傳播媒介主要是埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白紋伊蚊（Aedesalbopictus）。根據WHO發(fā)布的文獻顯示，近幾十年來世界DF的發(fā)病率在逐步上升，約有25億人生活在有可能感染DENV的疫區(qū)，全球每年約有5 000萬到1億人感染，其中以東南亞和西太平洋地區(qū)最為嚴重，在2008年和2010年報道的病例分別超過120萬和220萬［1］。目前尚無特效的治療藥物和安全可用的疫苗，因此對DF流行的控制主要還是以化學殺蟲劑控制媒介蚊蟲為主。然而化學殺蟲劑的長期使用，也帶來了一些副作用，如環(huán)境污染、生態(tài)環(huán)境破壞和蚊蟲抗藥性等。因此利用生物防治來控制DF已被越來越多的科學家所認可。

最近，利用共生菌沃爾巴克氏體（Wolbachia）作為一種生物制劑來減少蚊蟲種群數量和阻斷DENV傳播已經取得很大的進展。Wolbachia是一種類似立克次體的共生菌，廣泛存在于昆蟲和其他節(jié)肢動物的細胞內，基因組大小約為1.36 M kb，有A－H等多個亞群［2］。該共生菌能調控宿主的生殖，并可以垂直傳播，使感染的雌蟲宿主擁有生殖優(yōu)勢，包括細胞質不親和（cytoplasmic incompatibility）、雌性化（parthenogenesis inducing）、殺雄效應（male killing）和孤雌生殖（feminizing）［3］。

Wolbachia被視為可以抑制昆蟲和它所傳播的病原菌的一種潛在生物制劑，已在緬甸、澳大利亞［4］和越南［5］等國家開始進行野外放養(yǎng)感染有Wolbachia蚊蟲的實驗，并取得了初步的成效。本文就近年來Wolbachia蚊蟲野外試驗技術條件、生物安全情況和存在問題與展望作一綜述。

1 Wolbachia蚊蟲野外試驗技術條件

Wolbachia于1912年由Hertig和Wolbac在尖音庫蚊（Culexpipiens）的生殖細胞中被發(fā)現，隨后其與宿主的作用才慢慢被人們所了解［6］。雖然自然界中存在著豐富的Wolbachia共生菌資源（約40%的節(jié)肢動物存在感染）［7］，但真正使科學家們認為該共生菌能夠運用到實踐中的關鍵技術是運用了蚊卵顯微注射，成功地將它進行種群間的轉染［8］。例如DENV重要傳播媒介白紋伊蚊雖然存在自然雙重感染，但仍可以傳播該病毒，而其它重要蚊媒病傳播媒介埃及伊蚊和按蚊等自然沒有感染該菌，因此如不能從其他昆蟲物種轉染新的Wolbachia菌系，這會極大地限制了該共生菌的實際運用。轉染的菌系必須滿足4個條件：1.可以垂直傳播和誘導宿主發(fā)生CI；2.可以干擾或阻斷RNA病毒復制；3.在蚊蟲的傳播疾病的重要器官含量達到抑制病原體的最低密度；4.可以快速入侵野生種群，完成種群替代。

1.1 種間轉染 通過蚊卵顯微注射，成功地從白紋伊蚊蚊卵細胞質中的Wolbachia轉移到埃及伊蚊蚊卵內，孵化后的成蚊感染率達到100%，可誘導宿主發(fā)生CI和垂直傳播［8］。由于蚊卵顯微注射對卵造成的傷害比較大，后期孵化率不高，Ruang－areerate等［9］通過成蚊的胸腔注射Wolbachia，雖然存活率高，但是感染率并不能達到100%，且后代感染率僅穩(wěn)定在45%左右，Cook等［10］認為這是由于通過成蚊注射的蚊蟲生殖腺感染密度不高，從而導致垂直傳播效率低。雖然蚊卵顯微注射技術要求較高，但蚊卵一旦成功孵化，感染率可達100%，且產生的后代不會出現丟失該菌的情況［11］，因此蚊卵注射比成蚊注射更加科學有效。不同的Wolbachia類型對宿主的適應情況是不同的，有些亞群可以直接從自然宿主轉移到異常宿主體內，如將白紋伊蚊體內wAlb A和wAlbB轉移到埃及伊蚊體內［8］。而有些亞群對新宿主的適應性不強，無法直接感染新宿主或者垂直傳播效率過低，這必須讓該菌系在新宿主的細胞體系外進行培養(yǎng)，經過多代的培養(yǎng)適應后慢慢適應新宿主，但這過程一般需要幾年的時間。如必須將黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster）體內wMelpop在埃及伊蚊RML－12細胞株經過體外多次傳代培養(yǎng)后，才能成功地轉染到埃及伊蚊體內，并且有非常高的垂直傳播效率［10］。

1.2 阻斷病毒wMelpop屬于Wolbachia的 A亞群，其自然宿主為黑腹果蠅，研究發(fā)現wMelpop可以干擾其宿主體內的果蠅C病毒的復制，與沒有感染該菌的宿主相比，可以延遲宿主的死亡［12］。同樣，Bian等［13］也在感染wMelpop埃及伊蚊體內也發(fā)現相似的情況，感染蚊蟲體內DENV的拷貝數顯著低于沒有感染的蚊蟲。近來研究還發(fā)現，wMelpop不僅對DENV有阻斷作用，對基孔肯雅肯亞病毒（Chickungunya Virus）、雞瘧原蟲（Plasmodium gallinaceum）等也有抑制作用，說明該菌系擁有一種廣泛的阻斷病毒在宿主體內復制作用，然而具體機制仍不清楚［14］。Pan等［15］認為Wolbachia能誘導宿主體內發(fā)生氧化還原反應，激活“Toll通道”，從而抑制宿主體內病毒的復制。Frentiu等［16］則在細胞水平發(fā)現Wolbachia抑制病毒能力取決細胞內Wolbachia的密度，認為是該共生菌與細胞內病毒處于同一個細胞內，或存在著競爭宿主營養(yǎng)，從而干擾病毒在細胞內的復制。

1.3 組織分布 埃及伊蚊和白紋伊蚊是傳播DENV的兩種主要媒介昆蟲，前者無自然感染Wolbachia，而后者是自然雙重感染（wAlb A 和wAlbB）。Bian等［17］將wMelpop轉染到埃及伊蚊體內后，發(fā)現蚊蟲的各個組織器官（包括頭部、脂肪體、中腸、唾液腺、馬氏管和卵巢）均能感染wMelpop，且該菌含量在蚊蟲中腸和唾液腺這兩個組織器官中均能達到干擾DENV復制的密度。雖然白紋伊蚊存在自然超感染，但在中腸和唾液腺這兩個組織器官該菌的含量非常低，Lu等［17］在雙重感染不同濃度菌量Wolbachia的白紋伊蚊Aa23細胞中加入 DENV，發(fā)現隨著菌量增加，細胞中干擾DENV的能力不斷上升，說明了即使白紋伊蚊自然存在雙重感染，但由于在中腸和唾液腺等病毒復制的部位菌量非常低，達不到干擾病毒復制的密度，因此才成為 DENV 的傳播媒介。Blagrove［18］等將wMel轉移到無感染的白紋伊蚊體內（四環(huán)素清除共生菌），建立起單感染wMel的白紋伊蚊，轉染后該菌在白紋伊蚊體內的唾液腺含量相對高，喂養(yǎng)含DENV血餐后解剖蚊蟲的唾液腺，沒有發(fā)現DENV顆粒，而空白對照仍可發(fā)現DENV顆粒。這說明人工轉染Wolbachia后，共生菌能否在中腸、唾液腺和卵巢等重要部位達到一個相對高的密度，這對于干擾或阻斷病毒復制和能否垂直傳播是必不可少的。

1.4 種群替代 感染wMelpop要入侵到野生種群中，首先該菌必須能夠誘導宿主發(fā)生CI，并且在宿主生殖腺中密度相對較高，以保證高效率垂直傳播［3］。Mc Meniman 將［11］感 染wMelpop 的 埃 及 伊蚊雄蚊與沒有感染的雌蚊交配，誘導宿主發(fā)生CI，并對轉染了wMelpop埃及伊蚊的后代（第30、35代）進行隨機抽取檢測，發(fā)現仍是100%的陽性率。其次，wMelpop入侵種群速度必須足夠快，Walker等［19］在模擬自然環(huán)境的人工實驗室A和B中，釋放感染wMelpop的雌性埃及伊蚊，釋放比例都在0.65，隨著時間的增長，蚊蟲的感染率不斷上升，并分別在30 d和80 d后感染率達到一個穩(wěn)定值，均接近100%。而在野外實際放養(yǎng)中，wMelpop的入侵速度也是非常高，Hoffmann等［4］在澳大利亞東北部凱恩斯港口的Yorkeys Knob和Gordonvale釋放感染了wMelpop的雌性埃及伊蚊，并于3個月后發(fā)現這兩個釋放點埃及伊蚊wMelpop的感染率分別達到100%和90%。Wolbachia無論在實驗室或者在野外實踐放養(yǎng)中，都能夠誘導宿主發(fā)生CI，且入侵種群的速度是也是很快，可能只需要2～3代便可完成種群的替代。

2 Wolbachia蚊蟲的生物安全情況

將感染了Wolbachia的蚊蟲進行野外放養(yǎng)，是否會影響生物安全，對人類、動物或者環(huán)境和生物鏈造成不利的影響，這是人們對Wolbachia野外實踐運用最關心的問題：

2.1Wolbachia對人或者動物安全性 感染有Wolbachia的蚊蟲是否能通過叮咬人或者動物從而將體內的共生菌注入到人或者動物體內，從而產生不良的影響。Wolbachia是一種嚴格的細胞內共生菌，自然界中多種昆蟲均有感染，而在人類或者其他哺乳動物體內并沒有發(fā)現感染。人們將感染有Wolbachia的黑腹果蠅卵巢研磨后注射到雞胚和幼鼠的胸腔和大腦，均沒有發(fā)現由該菌所引起的癥狀和死亡［20］。一些實驗數據也說明Wolbachia是不會轉移到人類或者動物體內。電鏡結果表明，Wolbachia的大小直徑大約1～2μm，而蚊蟲的唾液腺導管的直徑小于1μm，這意味著即使該菌存在于分泌的唾液中，也不可能通過蚊蟲的叮咬將它注入到人類或者動物體內［21］。Western blots和 ELISA結果也表明屢次被攜帶Wolbachia的蚊蟲叮咬的人類會產生對抗蚊蟲成分的抗體，但沒有產生對抗該菌的IgG抗體，這表明該菌抗原在蚊蟲叮咬時并沒有感染人類，也沒有引起人類宿主的免疫應答［20］。

2.2Wolbachia對環(huán)境或者生物鏈影響 人們也擔心Wolbachia是否會通過水平傳播影響環(huán)境或者生物鏈。Wolbachia沒有感染性，而且必須得通過母系垂直傳播。研究發(fā)現，當宿主死去時，該菌將和宿主尸體一起降解，并對尸體周圍的植物葉、根和土壤進行檢測，均沒有發(fā)現該菌可以體外寄生［20］。自然界中每天均有大量感染Wolbachia的昆蟲死去，但在外部環(huán)境并無發(fā)現該菌獨立存在。Wolbachia通過顯微注射可以進行種間轉染，但這并不意味著該菌可以通過水平傳播感染其他物種，或者說這種水平傳播只存在一種非常低的概率事件中。人工轉染的過程，其實是Wolbachia在體外經過多代組織培養(yǎng)，已經達到對該組織的預適應性，從而才可以在新的宿主體內穩(wěn)定存在，且研究發(fā)現在適應過程中該菌株有大量的基因突變，但或許這對蚊蟲能夠感染該菌是存在著重要的意義［22］。自然界中，蚊蟲可作為大多數昆蟲的食物，那通過食用攜帶Wolbachia的蚊蟲是否會導致捕食者感染該菌。研究發(fā)現，對沒有攜帶Wolbachia的蜘蛛喂養(yǎng)感染該菌的蚊蟲，隨后對蜘蛛體內各個組織進行檢測，并沒有發(fā)現Wolbachia的感染，說明該菌并不會通過自然界中的生物鏈而感染其他物種［20］。

3 存在問題與展望

共生菌Wolbachia無論在實驗室［11］還是在初步野外試驗［4］的過程中都顯示出非常巨大的潛在優(yōu)勢，取得的效果也是非常不錯。該菌通過自身與宿主的相互作用，使其能夠快速入侵野生種群，或壓制種群數量［3］，或對大部分RNA病毒復制有干擾作用［12－14］，且對人類、動物、環(huán)境和生物鏈等均沒有影響［20］。然而對于Wolbachia的實際運用仍存在著一些問題，蚊蟲Wolbachia的野外試驗主要存在著安全性和其散播的可能性，雖然大量的實驗數據已表明該菌對人類、動物、環(huán)境和生物鏈是安全的，同樣，實驗的結果需要長時間和廣闊的地理區(qū)域才檢測到可能發(fā)生的后果，而評估這些實驗結果又將是一項艱巨的任務。許多關于長期后果的問題只有在開展放養(yǎng)蚊蟲活動后才可以評估，如像病毒對Wolbachia產生的基因變異，或經過Wolbachia不斷垂直傳播后是否仍有足夠的能力抑制病毒，或由于環(huán)境問題影響而引起蚊蟲自身的變化等，這些都是長期存在的科學問題，要解決這些問題將是一個艱巨的挑戰(zhàn)［20］。Wolbachia作為一種生物制劑，已經表現出巨大的潛在優(yōu)勢，不僅僅是可以控制蚊媒病的傳播，而且由于自然界中大部分昆蟲均有攜帶Wolbachia，因此甚至可以利用該菌應用到防治其他領域中的害蟲，如農業(yè)害蟲，這將又是一個重大突破。

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