LAMP技術在動物病毒病原檢測中的應用進展

周廣舟，徐蘇麗，譚曉榮，陳小兵

2.鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院，鄭州 450008

1 引言

環(huán)介導等溫擴增技術（Loop－mediated isothermal amplification，LAMP）是日本學者 Notmomi等［1］于2000年首先報道的一種新的核酸擴增技術。LAMP技術采用能特異識別靶序列上6個位點的4條引物及1種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件（一般為60～65℃左右）下，1 h內其擴增效率可達到109～1010個數(shù)量級。區(qū)別于傳統(tǒng)的PCR方法，LAMP技術不需要昂貴的PCR儀器，特異性強、等溫靈敏、操作簡單、擴增反應時間較短且易于觀察結果，利于在基層實驗室推廣使用等優(yōu)點，近來在各類醫(yī)學病原包括病毒、細菌、真菌、支原體和寄生蟲等傳染性疾病的檢測等領域得到了廣泛的應用，在疫病診斷領域顯示了廣闊的應用前景。目前在醫(yī)學（食品）微生物和寄生蟲等領域的檢測鑒定等方面已有較多的總結，如對日本血吸蟲、副溶血弧菌等的檢測［2－3］。本文主要就在臨床和科研實踐中利用基于LAMP的技術對各類醫(yī)學病毒的檢測及鑒定工作的報道做一綜述。

2 LAMP技術在常見病毒病的檢測應用

2.1 肝炎病毒 常見的如乙肝病毒和丙型肝炎病毒等均為常見的RNA病毒，可以通過血液和母嬰傳播等方式感染人而造成肝炎流行。臨床上目前對這類病毒的針對往往采取傳統(tǒng)的ELISA方法和套式RT－PCR等方法進行檢測，但往往由于低特異性和易交叉污染，結果往往并不可靠，造成臨床上的錯檢或漏檢。李啟明等［4］利用Reverse Transcription－LAMP（RT－LAMP）技術對60份經 Real－time PCR或RT－PCR驗證陽性的血清樣品進行檢測，陽性符合率達98%，檢測靈敏度可達到10個拷貝的RNA分子。Lan等［5］對68個包括糞便、血清、肝臟和膽汁等樣品內的HEV病毒進行檢測，檢出限為0.045 fg，比巢式（nest）RT－PCR的靈敏度高100倍。近來，不同研究小組在對肝炎病毒的RT－LAMP檢測上做了更多的探索和實踐，使之檢測更靈敏快速［6－7］。

2.2 流感病毒 流感是人類目前最重要的病毒性疾病之一，每年幾乎全世界10%－20%的人口都會遭受到季節(jié)性流感的侵襲并造成大約50～100萬人的死亡，帶來巨大的經濟負擔。有效的流感病毒檢測和疫苗接種是迅速建立人群免疫屏障、阻斷流感大流行蔓延、減少和降低其危害性的有效手段。針對2009年大流行的H1N1流感病毒血凝素（HA）基因，Kubo等［8］建立了 HA基因的 RT－LAMP檢測方法，檢測限與Taq Man RT－PCR類似，達到目標RNA的10個拷貝/反應體系，260個樣品中RTLAMP檢測到136個陽性，靈敏度和特異性分別達到97.8%和100%。最近，Hatano等［9］對 H1N1流感病毒的RT－LAMP檢測技術進行了新的改進和嘗試，使之操作更方便，結果更精確。除此之外，一些科學家還相繼建立了H5N1、H3型豬流感病毒等多株人獸（鳥）共感染病毒的RT－LMAP檢測技術［10－11］，大大推動了對這些病原的鑒定及致病機制研究的進程。

2.3 艾滋病毒 Curtis等［12］設計了針對 HIV－1病毒的6個蛋白酶和p24基因的特異性引物，利用RT－LAMP技術直接檢測細胞內和血清樣品里的HIV－1病毒，結果顯示在30 min內就可實現(xiàn)對HIV－1 DNA和RNA的檢測，在60 min時間內每個反應體系的檢測限為10和100個拷貝，并且不需要核酸提取步驟，節(jié)約了整個檢測時間。最近，該研究小組又建立了針對HIV－1特異性序列片段檢測的 RT－LAMP 技 術［13］。Hosaka等［14］也 建 立 了 類似的針對HIV－1病毒pol整合酶基因的快速一步RT－LAMP檢測技術。

2.4 狂犬病毒 狂犬病是迄今為止人類唯一病死率高達100%的急性傳染病，由狂犬病病毒引發(fā)的人與溫血動物的一種急性、致死性的自然疫源性疾病。但由于狂犬病毒往往是較長的潛伏感染狀態(tài)，易造成檢測不及時而未采取治療措施引起死亡。國外對狂犬病毒的RT－LAMP檢測鑒定工作在2009年就已開始有報道［15－16］。在國內，許丹等［17］針對狂犬病毒I型核蛋白（N）保守區(qū)設計了4條識別靶序列上6個位點的特異性引物，建立了該病毒的LAMP檢測方法，結果顯示，病毒基因的最低檢出量可達到10個拷貝數(shù)，反應特異性較強，已用于狂犬病毒的實驗室檢測和臨床初步診斷。最近，黃元等［18］就狂犬病毒大轉錄酶蛋白基因（L）的高度保守區(qū)設計引物，同樣成功建立了該病毒的快速一步式RT－LAMP檢測方法，靈敏度比RT－nest PCR高10倍以上，取得了較好的檢測效果。

2.5 單純皰疹病毒 單純皰疹病毒（HSV）是一類能引起皮膚病和性病的常見病原體，常見的有I型和II型兩個血清型，其中I型HSV在成年人血清中陽性率高達85%以上，感染后引起人的皰疹性角膜炎、口唇皰疹、皮膚皰疹等。常用的血清學檢測、病毒分離培養(yǎng)或PCR檢測方法往往費時繁瑣或需昂貴的儀器而不能大規(guī)模推廣，限制了這些技術的應用。周支香等［19］提取HSV－2病毒基因組后，設計了4條針對病毒糖蛋白基因的LAMP引物，建立了檢測HSV病毒的LAMP技術，檢測HSV－2的敏感性可達到0.01 ng/μL。彭丁晉等［20］利用 LAMP技術檢測了3例具HSV－1感染的臨床樣本，同樣顯示了較好的檢測效果。

2.6 冠狀病毒 最具代表性的例子是已建立的針對的嚴重急性呼吸綜合征病毒SARS－Co V的LAMP檢測技術。Hong等［21］在2003年SARS流行期間搜集的49個病人的口漱液、咽拭子和鼻咽拭子樣品中，RT－LAMP的檢測限為0.01PFU，靈敏度比傳統(tǒng)的RT－PCR高100倍，并且大多在不到1 h內完成檢測，最快的只有11 min。此后，Poon等［22］還建立了新的 Real－time LAMP 技術來 檢 測SARS－Co V，比較了傳統(tǒng)的熒光定量PCR技術同LAMP技術的檢測靈敏度差異，結果顯示并沒有明顯的分別，提示LAMP技術可以做為一個實用簡便的檢測手段進行大規(guī)模應用。目前，其它一些冠狀病毒的LAMP檢測方法也相繼建立起來［23－24］。

2.7 登革病毒 登革病毒（Dengue virus，DEN）是登革熱、登革出血熱/登革休克綜合征（DHF/DSS）的病原體，廣泛流行于全球熱帶及亞熱帶的國家和地區(qū)，已造成這些地區(qū)嚴重的公共衛(wèi)生問題。為了快速檢測和區(qū)分登革病毒血清型，Parida等［25］建立了一步法實時定量血清型特異性RT－LAMP檢測方法，分別用實時濁度儀監(jiān)測、瓊脂糖凝膠電泳、自然光和紫外光下肉眼觀察SYBR GreenI顏色變化判定結果。對總共63例臨床診斷病人和疑似病例血清樣本的檢測中發(fā)現(xiàn)，RT－LAMP的檢測靈敏度為100%，同比RT－PCR和病毒培養(yǎng)法檢測提高13%和19%，而且特異性也較高，能夠確定不同血清型的登革病毒。

2.8 乙腦病毒 流行性乙型腦炎病毒，簡稱為乙腦病毒，本病毒首先于1953年在日本從患者腦組織中分離獲得，又稱為日本乙型腦炎（Japanese encephalitis virus，JBE）屬于蟲媒病毒黃病毒科黃病毒屬，蚊是其傳播的媒介和貯存宿主。不同的研究小組早在2006年就分別獨立地建立了針對JEV病毒的RT－LAMP檢測方法，并顯示有較好的診斷效果［26－27］。最近，Chen等［28］就 RT－LAMP 診斷方法同傳統(tǒng)RT－PCR和熒光定量PCR檢測方法進行了比較分析。結果顯示RT－LAMP的檢測靈敏度同熒光定量PCR相當，但是傳統(tǒng)RT－PCR的10倍，檢測限達到24拷貝/微升。交叉檢測也表明RTLAMP技術的特異性也較高，同登革2型病毒、狂犬病毒、諾如病毒、星狀病毒和人腸道71型病毒均無交叉反應，表明RT－LAMP技術可以作為臨床分子水平檢測的重要工具用于乙腦病毒的診斷。而Perera等［29］利用 RT－LAMP技術篩查攜帶病毒的蚊蟲也取得了很好的效果，以整個蚊體為模板在30min內就可以快速簡便地鑒定是否為攜毒蚊。

2.9 其它病毒 近年來，學者們對其它的一些不常見的醫(yī)學病毒也陸續(xù)建立了類似的LAMP檢測方法用于病毒的鑒定和病例的診斷，如風疹病毒［30］、諾如病毒［31］、嗜 T 淋巴細胞病毒（HTLV）［32］、柯薩奇病毒［33］等，在特異性和靈敏度上都具很高的水平。

3 展 望

當前，諸如SARS、人感染高致病性禽流感、新型H1N1流感等一些新發(fā)病毒性傳染病疫情不斷出現(xiàn)，對社會公眾健康造成了嚴重損害。對這些影響大的傳染病疫情，快速、準確地做出病原學診斷是及時有效控制疫情，將損害降到最低限度的保證。作為一種快速、簡便、靈敏、特異，無需貴重檢測設備而易普及的檢測技術，LAMP診斷方法將在很大程度上發(fā)揮重要的作用。它的整個過程均在恒溫條件下進行，避免了常規(guī)PCR對于溫度循環(huán)的特殊要求所帶來的各種不便。雖然對于某些病毒的檢驗，LAMP的靈敏度和特異性尚未超越熒光定量PCR等方法，但在很大程度上LAMP已經符合了臨床所需的要求。

但LAMP檢測技術同樣存在一些不足，主要體現(xiàn)在：LAMP檢測陽性反應呈現(xiàn)梯度條帶，不像PCR呈現(xiàn)單帶，一旦產生非特異性擴增則不易鑒別。此外，由于反應靈敏度高，外界物質的介入很容易造成假陽性，尤其要防止電泳過程中氣溶膠的污染。但是，隨著LAMP技術的不斷發(fā)展完善，必將在檢驗檢疫乃至整個生物學檢測領域占有一席之地，特別是在一些基層實驗室、床邊檢測和流行病學調查等領域具有廣闊的應用前景。

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