繁殖生物技術(shù)在水牛生產(chǎn)中的應(yīng)用研究

(廣西玉林市水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局，廣西玉林 537000)

水牛是我國南方地區(qū)飼養(yǎng)的本地品種，適應(yīng)性和抗病力較強、耐高溫高濕、耐粗飼、易飼養(yǎng)、使用年限長，且水牛奶營養(yǎng)豐富。我國水牛品種資源豐富，存欄量居全球第三位，但飼養(yǎng)的水牛均為沼澤型，體型較小且生長緩慢，產(chǎn)奶性能較低，年均產(chǎn)奶量僅1000 kg左右。20世紀(jì)50年代和70年代，我國先后從印度和巴基斯坦引進摩拉水牛和尼里-拉菲水牛各50頭，對本地水牛進行雜交改良。引入的河流型水牛，體型較大，生長較快，產(chǎn)奶量較高，與本地水牛雜交后代奶水牛年產(chǎn)奶量可達1200～2000 kg，可明顯提高本地水牛的產(chǎn)奶性能。

發(fā)展奶水牛養(yǎng)殖，投資少，風(fēng)險小，效益高。尤其是近20年來，我國不少地區(qū)加大了水牛資源開發(fā)的經(jīng)費投入，明確提出把發(fā)展水牛奶業(yè)作為發(fā)展農(nóng)村經(jīng)濟新的增長點，提出開發(fā)利用水牛是全國農(nóng)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟結(jié)構(gòu)調(diào)整，增加農(nóng)民收入，解決農(nóng)村富裕勞動力就業(yè)的重要途徑。為此，不少地區(qū)專門成立了水牛研究所和水牛種公牛站，用于水牛的科學(xué)研究和種牛供應(yīng)。特別是開展水牛繁殖生物技術(shù)的應(yīng)用研究，第一階段是對水牛超數(shù)排卵和活體采卵、胚胎性別鑒定和胚胎移植等一整套胚胎生物技術(shù)進行研究和開發(fā)，主要目標(biāo)是提高水牛品質(zhì)和新品種的形成。第二階段是采用轉(zhuǎn)基因和體細(xì)胞克隆等技術(shù)，以培育水牛新品種和提高水牛養(yǎng)殖效益。

1 超數(shù)排卵和同期發(fā)情

一般母牛每次發(fā)情只排一枚卵。人們通過使用外源激素，能使母牛一次排多枚卵以生產(chǎn)多個胚胎，通過胚胎移植加快優(yōu)良母牛的基因擴散。水牛卵巢上原始卵泡數(shù)比奶牛低30%，卵泡閉鎖率較奶牛高，且水牛對超排藥物反應(yīng)力低，個體反應(yīng)差異大。因此，胚胎回收率遠(yuǎn)低于奶牛。近年來，水牛的胚胎回收率雖有很大提高，可用胚胎可高達2.5～3.0枚，但大多數(shù)仍在1.0～2.0枚左右。常用于水牛超排的促性腺激素有PMSG(孕馬血清促性腺激素)和FSH(促卵泡素)，F(xiàn)SH的超排效果優(yōu)于PMSG，每次超排獲得有效胚胎的數(shù)量是2.09比0.56。

同期發(fā)情技術(shù)可便于掌握適時輸精，縮短發(fā)情配種時間，有利于提高人工授精配種受胎率和胚胎移植受胎率。近年來，國內(nèi)對水牛同期發(fā)情技術(shù)的應(yīng)用做了初步研究，發(fā)展了多種同期發(fā)情方法應(yīng)用于誘導(dǎo)發(fā)情和排卵，如孕酮法、兩次PGF2α法，GnRH 結(jié)合前列腺素法、孕酮和ECG 方法等。研究表明通常有優(yōu)勢卵泡和黃體存在時處理成功率較高；在繁殖季節(jié)同期發(fā)情的效果較好；在乏情季節(jié)，結(jié)合使用孕酮可提高受胎率。

由于水牛對激素類藥物的反應(yīng)力較低，個體差異較大，而且多出現(xiàn)安靜發(fā)情，因此超數(shù)排卵和同期發(fā)情的效率仍然較低。需要制訂中長期的研究計劃，探討水牛卵泡發(fā)生和繁殖內(nèi)分泌規(guī)律，找出有效的發(fā)情鑒定方法。

2 胚胎體外生產(chǎn)

胚胎體外生產(chǎn)(IVP)包括卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)、體外受精(IVF)和體外胚胎培養(yǎng)(IVC)。通過IVP可大量生產(chǎn)良種胚胎，是解決水牛品種改良過程中胚胎來源困難的一條有效途徑。胚胎體外生產(chǎn)的卵母細(xì)胞來源主要分為屠宰場卵巢和活體采卵(OPU)。屠宰場卵巢容易獲得，但由于系譜不明確，且絕大部分為沼澤型水牛卵巢，因此對水牛品種改良的意義不大。OPU通過B型超聲波引導(dǎo)，經(jīng)子宮壁采集卵母細(xì)胞，可重復(fù)從遺傳價值較高的水牛采集卵母細(xì)胞，與體外受精技術(shù)相結(jié)合可生產(chǎn)大量系譜明確的胚胎，從而充分利用優(yōu)良母牛的遺傳潛力。OPU與體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)相結(jié)合，生產(chǎn)的可移植胚胎為超數(shù)排卵的2～3倍，每頭供體每月可生產(chǎn)更多的可移植胚胎(2.0±0.6枚)，且可克服母牛生殖道疾病對胚胎質(zhì)量的影響。

體外胚胎生產(chǎn)雖已取得一定成績，但水牛胚胎體外生產(chǎn)所需條件較高，需要專門的儀器設(shè)備進行操作，實質(zhì)上仍處于研究階段，尚未真正應(yīng)用于生產(chǎn)。今后應(yīng)降低胚胎體外生產(chǎn)成本，提高體外生產(chǎn)效率。目前已由專業(yè)單位進行良種胚胎體外生產(chǎn)，而后將胚胎冷凍保存，提供給基層水牛養(yǎng)殖戶進行移植生產(chǎn)。

3 胚胎移植

胚胎移植是水牛超數(shù)排卵、體外受精、體細(xì)胞核移植的最終環(huán)節(jié)，對良種水牛的擴繁具有重要意義。胚胎移植首先要解決供體母牛與受體母牛發(fā)情同期化問題，常用的方法與供體母牛情期同期化處理基本一樣，受體母牛注射兩次PG或其衍生物，使注射間隔時間11 d。胚胎移植的操作關(guān)鍵是將胚胎準(zhǔn)確地輸入到卵巢有黃體的子宮角中。由于水牛黃體突出表面不明顯，難以觸診，給胚胎移植準(zhǔn)確到位帶來了一定困難。母牛子宮頸在發(fā)情后不久就處于基本閉鎖狀態(tài)，使輸胚管插入困難并容易造成子宮損傷，影響胚移受胎率。為了提高受胎率，一般以選用已產(chǎn)2胎以上的母牛作為受體母牛較好。

由于受體牛的質(zhì)量不能保障，所以水牛胚胎移植效率較低，一般水牛鮮胚移植受胎率只有6%～13%，個別試驗受胎率達到33.7%～66.7%，胚移受孕水牛3個月內(nèi)流產(chǎn)比例較高，流產(chǎn)率有時可達40%～50%。因此應(yīng)加強和建立規(guī)范的受體母牛飼養(yǎng)管理，開展胎兒互相作用和胚胎發(fā)育免疫學(xué)研究，以提高水牛胚胎移植效率。

4 胚胎冷凍

胚胎冷凍技術(shù)可突破時間和空間限制，解決胚胎生產(chǎn)與移植在時間和地域方面的矛盾，實現(xiàn)水牛胚胎本地生產(chǎn)異地移植，還可長時間保存優(yōu)良種水牛的遺傳資源，便于胚胎運輸，促進水牛繁殖生物技術(shù)的推廣應(yīng)用。

但因種種原因，水牛胚胎冷凍技術(shù)尚未得到廣泛應(yīng)用。今后應(yīng)深入廣泛開展水牛胚胎冷凍保存技術(shù)研究，從冷凍保護劑、冷凍方法、胚胎發(fā)育階段等方面進行深入研究，以切實提高水牛胚胎的冷凍存活率，加速胚胎冷凍技術(shù)的應(yīng)用。

5 性別控制

目前，實現(xiàn)家畜性別的人為控制主要有兩個途徑：一是X 精子和Y 精子的分離；二是早期胚胎的性別鑒定。研究表明，將牛的精子分離后進行人工授精，產(chǎn)下母水牛的成功率為94%，公水牛的成功率為91%。使用流式細(xì)胞分類儀分離X、Y 精子，準(zhǔn)確率達90%以上，分離的精子用于體外受精，生產(chǎn)的胚胎移植后產(chǎn)下經(jīng)XY精子性別控制的雌雄水牛雙犢。通過胚胎分割結(jié)合PCR技術(shù)進行性別鑒定，切割胚胎移植后得到了性別控制水牛犢；其胚胎性別鑒定的準(zhǔn)確率可達100%，胚胎分割后的存活率可達80%以上。

使用性別控制技術(shù)進行繁育奶水牛的效率將比無性別控制的提高1倍左右，對加速繁殖良種水牛，推動水牛奶業(yè)發(fā)展具有重大現(xiàn)實意義。

6 體細(xì)胞核移植及轉(zhuǎn)基因研究

體細(xì)胞核移植在短期內(nèi)可大量復(fù)制具優(yōu)良基因的動物個體，并為轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究提供基礎(chǔ)。水牛的體細(xì)胞核移植研究開始較晚，操作復(fù)雜，影響因素較多。自2005年首例水牛體細(xì)胞克隆牛犢誕生，到目前為止，僅報道3例成活的克隆水牛。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是基因工程和胚胎工程結(jié)合的一門生物技術(shù)。轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)是使用轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)將選定的目的基因?qū)雱游锶旧w組，并整合表達和遺傳的過程。通過轉(zhuǎn)基因克隆方法對水牛進行定向遺傳改良和研發(fā)高效乳腺生物反應(yīng)器，可解決水牛奶業(yè)開發(fā)面臨的水牛繁殖率低和產(chǎn)奶量低等問題，提高水牛的經(jīng)濟價值。

國家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ椫卮笳n題“高繁殖力和高產(chǎn)奶量轉(zhuǎn)基因水牛新品種培育”立項后，已先后培育出世界首例單精子顯微授精的轉(zhuǎn)基因水牛、世界首例慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因水牛、世界首例轉(zhuǎn)基因克隆水牛。該課題將采用先進轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良水牛的遺傳性狀，提高水牛的繁殖力和產(chǎn)奶量，培育高繁殖力和高產(chǎn)奶量的水牛新品系，提高水牛養(yǎng)殖效益。

水牛業(yè)是正在崛起的新興產(chǎn)業(yè)，水牛業(yè)的發(fā)展直接和間接影響著“三農(nóng)”問題的解決，是不可忽略的問題。水牛繁殖受氣候和季節(jié)的影響較大，發(fā)情征兆不明顯給發(fā)情鑒定帶來一定困難，發(fā)情間隔時間長、受胎率低，這些因素制約著水牛的繁殖力。盡管如此，通過科研人員對水牛繁殖內(nèi)分泌學(xué)的研究，以及對水牛人工授精、胚胎移植、體外受精、胚胎冷凍等生物技術(shù)的研究，使水牛繁殖性能的提高呈現(xiàn)了希望。隨著超數(shù)排卵、核移植、轉(zhuǎn)基因等新興生物技術(shù)在水牛生產(chǎn)中的研究，相信將來水牛的遺傳潛力和水牛奶業(yè)將會得到更好的發(fā)展。