異質(zhì)性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌：困擾我們的難題

劉亞麗，徐英春

萬古霉素是治療甲氧西林耐藥金葡菌（MRSA）感染的有效藥物，也是治療該菌感染的最后選擇，目前該藥已在臨床上廣泛使用。雖然萬古霉素耐藥金葡菌（VRSA）在全球的檢出率很低，但萬古霉素低水平耐藥的金葡菌，包括異質(zhì)性萬古霉素中介金葡菌（hVISA）和萬古霉素中介金葡菌（VISA）卻在多個國家和地區(qū)廣泛流行。以改良菌群譜型分析－曲線下面積法（PAP－AUC）作為檢測hVISA的金標準，美國hVISA 的檢出率為0.3%～15.0%［1－7］，澳大利亞25.0%～37.6%［8－9］，日本10.0%［10］，中國9.5%～13.1%［11－12］，加拿大5.3%［13］，愛爾蘭2.3%［14］等。目前研究表明，與萬古霉素敏感金葡菌（VSSA）相比，hVISA導致萬古霉素治療失敗的概率是前者的2.37倍（95%CI，1.53～3.67），且住院時間明顯延長，住院費用增加［15］。現(xiàn)就hVISA的流行病學特點、檢測方法、異質(zhì)性耐藥機制及其導致感染的治療進行簡要介紹，為臨床醫(yī)師及微生物工作者提供參考。

一、hVISA的流行病學特點

2004年，Howe等［16］對來自11個國家的101株hVISA／VISA的基因型進行分析，發(fā)現(xiàn)所有菌株均屬于agrⅠ型或agrⅡ型，且以agrⅠ型為主（7／9 VISA，57／92 hVISA）；同時，hVISA 在 CC5、CC8、CC22、CC30和CC45的5個克隆復(fù)合體中均有發(fā)現(xiàn)，而VISA僅存在于CC5和CC8 2個克隆復(fù)合體中。但近期美國的2項研究表明，hVISA／VISA主要存在于agrⅡ型中［17－18］；來自澳大利亞的數(shù)據(jù)顯示，46株 hVISA 均屬于 ST239－MRSASCCmecⅢ克隆［19］。我國 Sun等［11］對26株 hVISA臨床分離株的基因型分析發(fā)現(xiàn)，hVISA以agrⅠ－SCCmecⅢ－ST239型為主，其次是agrⅡ－SCCmecⅡ－ST5；陳宏斌等［12］分離的30株hVISA 中，agrⅡ－SCCmecⅡ最多，其次是agrⅠ－SCCmecⅢ。這些數(shù)據(jù)表明，并非所有的MRSA均可能發(fā)展成hVISA。hVISA的流行可能與其遺傳背景以及不同地域的流行病學特點相關(guān)，如該地MRSA的分離率、耐藥譜型、流行克隆株的基因型特點等。

此外，hVISA也可存在于甲氧西林敏感金葡菌（MSSA）中，法國（hVISA，7／2 300）［20］和美國（hVISA，3／121）［3］均有報道。這說明在常規(guī)檢測中，不能僅依靠體外藥敏和菌株特點，還要結(jié)合臨床信息來判斷，如患者是否存在嚴重基礎(chǔ)疾病、入住ICU、萬古霉素低劑量治療、糖肽類治療無效等情況，當上述情況存在時，即使體外藥敏試驗結(jié)果是敏感的，也應(yīng)高度關(guān)注hVISA的存在。

二、hVISA的檢測

由于hVISA體外藥敏常顯示敏感（MIC≤2 mg／L），僅在子代（10－5～10－6）中含有少量對萬古霉素中介的 （MIC≥4 mg／L）的亞群，故給常規(guī)檢測帶來很大困難。研究表明，在萬古霉素體外敏感的狀態(tài)下，隨著MIC值的增加，hVISA的檢出率也逐漸上升，并在萬古霉素 MIC值為2 mg／L時，hVISA 的分離率最高［1，19，21］。van Hal等［19］利用微量肉湯稀釋法，對分離的46株hVISA的萬古霉素MIC值分布進行分析，發(fā)現(xiàn) MIC值≤0.5、1.0、1.5、2.0、4 mg／L時，上述hVISA 所占比率分別為2.2%、8.7%、6.5%、82.6%和0。這表明，對 MIC值處于敏感臨界的菌株應(yīng)給予高度關(guān)注，尤其是患者存在嚴重的基礎(chǔ)疾病、入住ICU、MRSA定植或反復(fù)感染、萬古霉素劑量偏低、糖肽類治療無效，應(yīng)高度懷疑存在hVISA。

目前，檢測hVISA的方法有多種，PAP－AUC是檢測hVISA的金標準，該方法以Mu3作為參考菌株，利用Graphpad Prism軟件，繪制菌落數(shù)對數(shù)值對萬古霉素濃度的曲線，計算曲線下面積（AUC），并將AUC待測菌株／Mu3介于0.9～1.3判定為hVISA。由于該方法費時費力、且需要特殊儀器螺旋涂布儀，故很難在常規(guī)實驗室進行。宏量E試驗（Macromethod E－test，MET）法，與標準 E 試驗法不同的是，需配制2.0麥氏濁度單位的菌懸液，取200μL菌懸液均勻涂布于腦心浸液（BHI）瓊脂平皿上，35℃孵育48 h后觀察結(jié)果。如萬古霉素和替考拉寧的 MIC均≥8 mg／L或替考拉寧 MIC≥12 mg／L則可判斷為hVISA。國外數(shù)據(jù)顯示，MET法的靈敏度和特異度分別為44.0%～98.5%和89%～98%［4，13，22］；我國數(shù)據(jù)顯示，MET 法的靈敏度和特異度分別為48.1%～70.4%和48%～85%，稍低于國外數(shù)據(jù)［11］。由于MET法操作簡單，靈敏度和特異度相對較高，可用于常規(guī)疑似菌株的初篩，但因價格昂貴，不適合大規(guī)模篩查。E試驗GRD（glycopeptide resistance detection）是一種新的hVISA檢測方法。其與MET法的區(qū)別在于需要使用MHB配制0.5麥氏濁度的菌懸液，并將菌液均勻涂布于含5%羊血或馬血的MHA平皿上，使用兩端分別含有替考拉寧和萬古霉素的特制E試驗條，在24 h和48 h分別讀取結(jié)果。判定標準為MIC替考拉寧≥8 mg／L或 MIC萬古霉素≥8 mg／L，同時標準 E 試驗 MIC萬古霉素＜4 mg／L 時，則判斷為hVISA。研究數(shù)據(jù)顯示，24 h讀取結(jié)果的敏感度和特異度分別為43% ～77% 和 98% ～100%［4，22］，48 h讀取結(jié)果的敏感度和特異度分別為57%～100%和 36% ～96%［4，13，22］。瓊脂稀釋法是美國CDC與臨床和實驗室標準化協(xié)會推薦的篩選方法［23］，配制0.5麥氏濁度的菌懸液，取10μL接種至含萬古霉素6 mg／L的BHI瓊脂（BHIA6V）上，35℃培養(yǎng)，24 h和48 h時各觀察1次，如有≥2個菌落生長則判斷為陽性；此外，也可采用含5 mg／L替考拉寧的BHI瓊脂（BHIA5T）或 MHA（MHA5T）平皿進行篩選，該方法的敏感性較BHIA6V高，但特異性差，由于成本低、無需特殊儀器，故適合大規(guī)模初篩。Sun等［11］的研究結(jié)果顯示，BHIA5T和BHIA6V的敏感度分別為88.9%和3.7%，特異度分別為17.3%和98.8%。

除上述方法外，采用含4 mg／L萬古霉素且加入16 g／L酪蛋白的BHI瓊脂進行hVISA的篩選，48 h后觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法的靈敏度和特異度分別為91%和94%［4］；此外，van Hal等［8］報道，利用微量肉湯稀釋法測定體外萬古霉素的MIC值，如將MIC≥2 mg／L作為判定折點篩選hVISA，其靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準確度分別為82%、97%、97%、80%和95%。這些數(shù)據(jù)說明，不同研究所得出的結(jié)果不同，由于方法不統(tǒng)一，很難進行比較和評價；但不同國家或地區(qū)以PAP－AUC作為金標準，可對不同方法的靈敏度、特異度、準確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值進行分析比較，結(jié)合當?shù)鼐甑牧餍胁W特點，選擇適當?shù)臋z測方法。

三、hVISA異質(zhì)性耐藥的機制研究

目前，hVISA的耐藥機制仍不清楚。表型研究的結(jié)果提示，細胞壁增厚、肽聚糖交聯(lián)減少、青霉素結(jié)合蛋白改變、自溶活性降低、細胞壁翻轉(zhuǎn)率增加、毒力降低、生長率下降、革蘭染色變淺、脲酶活性增強等可能與對萬古霉素的敏感性下降有關(guān)［22］。利用基因組及轉(zhuǎn)錄組學方法，已發(fā)現(xiàn)了多個與糖肽類耐藥相關(guān)的基因如pbpB、pbpD、ddh 、tcaA、msrA2、msrR、malR、lysC、graA、graB、graC、graD、graE、murZ、rsbU 等，這些基因表達的增高或降低，可直接或間接地影響對萬古霉素的敏感度［24－25］。此外，在 VSSA發(fā)展成hVISA、VISA 的過程中，幾個重要調(diào)控元件發(fā)生了點突變［vraS（I5 N ）、graR （N197S）、rpoB （H481Y ）、rpoB（A621E）］或缺失突變（walRK、clpP），并通過基因敲除和回補技術(shù)等證實了其在萬古霉素耐藥中發(fā)揮的重要作用［26－28］；同時，其他一些重要的調(diào)控子，如Agr、SigB、SarA、Rot、MgrA等在金葡菌代謝、毒素分泌及萬古霉素耐藥中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［3，29－31］，它們可能形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控多種基因的表達。此外，利用蛋白質(zhì)組學方法已發(fā)現(xiàn)多個蛋白質(zhì)與萬古霉素的異質(zhì)性耐藥緊密相關(guān)，如肽聚糖水解酶（LytM）、轉(zhuǎn)糖基酶樣蛋白（SceD）等，但具體機制仍需更深入研究。

四、hVISA感染的治療

雖然，常規(guī)體外藥敏顯示大部分hVISA對多種抗菌藥物（包括萬古霉素）敏感，但臨床治療結(jié)果并不樂觀。多項研究已證實，糖肽類治療常會失敗，部分hVISA可對達托霉素的敏感性降低［32－33］。目前還沒有研究證實，其他抗菌藥物或替代方案的療效優(yōu)于萬古霉素。故治療的藥物選擇仍是困擾臨床醫(yī)生的難題。2011年1月美國感染病學會成人與兒童MRSA感染治療指南［34］建議：對于萬古霉素 MIC≥2 mg／L菌株引起的感染，應(yīng)改用其他有效的藥物，如達托霉素、利奈唑胺、奎奴普?。_福普汀、甲氧芐啶－磺胺甲口惡唑以及特拉萬星等。對于萬古霉素治療失敗的持續(xù)性MRSA血流感染患者，應(yīng)尋找并清除可能存在的其他感染灶，進行引流或清創(chuàng)；若達托霉素敏感，可給予大劑量達托霉素聯(lián)合其他藥物治療；如菌株對萬古霉素和達托霉素敏感性均降低，可選用奎奴普丁－達福普汀、甲氧芐啶－磺胺甲口惡唑、利奈唑胺或特拉萬星進行治療。

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