血管成形術后再狹窄與平滑肌細胞轉化和遷移及轉化生長因子α表達上調有關

褚 春楊 軍王蘇燕丁賽良鄺 孛鄧 彪江振濤

（1 南華大學附二醫(yī)院藥劑科，湖南 衡陽 421001；2 南華大學附一醫(yī)院心內科，湖南 衡陽 421001）

血管成形術后再狹窄與平滑肌細胞轉化和遷移及轉化生長因子α表達上調有關

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（1 南華大學附二醫(yī)院藥劑科，湖南 衡陽 421001；2 南華大學附一醫(yī)院心內科，湖南 衡陽 421001）

目的 為探討血管成形術后再狹窄形成與平滑肌細胞（Smooth muscle cells，即SMCs）的遷移和表型轉化，以及轉化生長因子α（Transforming growth factor-α，即TGFα）在內膜增生過程中的表達變化的關系。方法 取40只Sprague-Dawle大鼠行右頸總動脈球囊內膜剝脫術建立再狹窄動物模型，于第1，3，9，28天和2月取實驗動脈段和對側正常動脈段行光鏡觀察及計算機圖像分析，同時在透射電鏡下觀察SMCs亞微結構變化。并以放免測定內膜增生時損傷血管組織中TGFα表達的變化。結果 圖像分析顯示在球囊損傷第3天即見損傷血管中膜出現明顯增厚，而后恢復正常厚度。與此同時球囊損傷第3天內膜明顯增厚，而在第9～28天逐漸達到高峰；在透射電鏡下觀察可見：術后第3天損傷血管增生內膜中近腔面的SMCs就已主要表現為合成表型，在28d和2個月時大部分SMCs又恢復收縮表型的形態(tài)特征。而通過放免測定發(fā)現球囊損傷后第3天對血管組織TGFα表達明顯增加，與對側正常頸總動脈標本中的TGFα含量有統(tǒng)計學意義的差異。結論 故認為大鼠再狹窄模型的內膜增生過程具有明顯的時相特征，SMCs從中膜向內膜的遷移，而SMCs的表型轉化在這過程中顯示出明顯的雙向轉化特點，而TGFα在損傷血管的表達明顯增加，可能參與了內膜過度增生過程的SMCs的表型轉化和遷移的機制。

SMCs；轉化生長因子α；再狹窄；血管內膜；損傷

經皮腔內冠狀動脈成形術在冠心病治療中已得到日益廣泛的應用，但在臨床上也面臨著一個嚴峻的挑戰(zhàn)——那就是術后再狹窄的發(fā)生，國內外學者對再狹窄預防進行了大量的實驗研究及臨床試驗，但并未完全解決PCI術后再狹窄問題，為有效降低再狹窄發(fā)生率，人們對PCI術后再狹窄的發(fā)生機制進行了更深入的研究和探討。

人們已經發(fā)現再狹窄發(fā)生是中膜SMCs表型轉化后遷移到內膜不斷增殖，不斷分泌細胞基質的結果[1]。本實驗擬通過大鼠再狹窄動物模型觀察內膜增生時中膜SMCs表型轉化及細胞亞微結構的變化，同時觀察TGFα在內膜增生過程中表達的變化，為PTCA術后再狹窄發(fā)生機制的研究提供進一步的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 頸總動脈球囊損傷大鼠動物模型的制備

取Sprague-Dawle大鼠（體質量400～500g，雄性，由廣州醫(yī)學院實驗動物中心提供）40只用戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉后；在頸前作一正中切口，鈍性分離左右頸總動脈，結扎遠側段，近端線拉阻斷血流。在兩線間靠剪一小口，緩慢逆行插入PTCA球囊導管，維持壓力為3大氣壓，緩慢回拉導管平切口處，再減壓至零。重復3次后退出導管。最后縫合切口，給予青霉素20萬單位肌注以預防感染。術后1d、3d、9d、28d和2月處死動物。按照取材時間隨機分成5個亞組，每個亞組各8只。

1.2 頸總動脈的病理切片檢查

動物處死后取下雙側血管標本，左側未損傷血管標本作實驗內對照。標本固定后、切片后常規(guī)蘇木精-伊紅染色，光鏡觀察形態(tài)學變化。以內彈力膜與內膜面之間組織為新生內膜，以外彈力膜與內彈力膜之間組織為中膜，計算機圖像分析系統(tǒng)測定中膜厚度、內膜面積、內膜面積增生比率=內膜面積/（內膜面積+中膜面積）×100%。

1.3 透射電鏡觀察

取大鼠損傷頸動脈和血管標本，大小約1mm3，4℃固定后經磷酸緩沖液浸洗后，用1%的四氧化鋨后固定固定30min，沖洗后1%水質醋酸鈾染色。PBS沖洗；12h后70%酒精梯度逐級脫水后，包埋、超薄切片，以醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，用透射電鏡觀察。

1.4 TGFα含量的放免測定

取術后第3天處死的大鼠左右頸總動脈標本研磨制勻漿，按TGFα放免測定試劑盒說明書測定，在自動ā計數儀上測放射性，并得出樣品TGFα濃度（pg/mL）。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結 果

實驗中1只大鼠因手術意外而死亡，其余動物都在術后存活直至完成本實驗。

2.1 光鏡觀察結果

對側正常血管切片的內彈力膜完整，內膜由單層內皮細胞構成，無SMCs侵入。而球囊損傷后可見明顯的內膜損傷及過度修復所致的內膜增生。術后第3天即可見內膜，中膜和外膜都有明顯增厚，中膜可見大量梭形SMCs，排列紊亂。術后第9天時內膜進一步增厚，新生內膜中可見大量SMCs，纖維成分增多。28d時新生內膜進一步增厚，但內膜中SMCs數量明顯減少，出現大量細胞間質堆積。2月后的血管標本的病理變化與術后第28天時相似，細胞間質替代SMCs成為增生內膜的主要成分。

2.2 病理圖象分析結果

對側正常頸動脈的中膜厚度、內膜面積、外膜下面積的各亞組之間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。實驗中，球囊損傷內膜后3d，9d，28d和2月，新生內膜面積分別0.05±0.020，0.13±0.06，0.24±0.09，0.25±0.07和0.24±0.08μm2。同時外膜下面積和內膜加中膜面積也呈現出相應的時相變化。損傷后3d，9d，28d和2月的內膜/內膜加中膜面積分別為0.166±0.127，0.326±0.209，0.305±0.509和0.312± 0.484（與對側正常頸動脈比較均為P＜0.05）。在對血管中膜厚度的觀察我們也發(fā)現：內膜損傷后不久，中膜即出現增厚，并在第3天有一個明顯的高峰（與對側正常血管相比分別為202.67±8.45和132.39±19.20，P＜0.01），而到第9天時雖然內膜明顯增生，但中膜厚度卻已恢復到正常血管厚度。

2.3 透射電鏡觀察結果

由透射電鏡可看到：從術后第3天，增生的內膜中近腔面的SMCs就已主要表現為合成表型：細胞異形，胞漿內細胞器增多，可見大量的線粒體、粗面內質網、溶酶體和高爾基體等，肌絲則明顯減少，同時可見較多炎性細胞和巨噬細胞的浸潤。到術后28d，在增生內膜中大部分的SMCs都恢復為梭形的收縮表型，胞漿內細胞器減少，但部分細胞的胞漿中仍可見溶酶體、線粒體等細胞器的增生，細胞間有大量的膠原纖維堆積，并可見巨噬細胞，增生內膜表面未見到有內皮細胞覆蓋。

2.4 TGFα含量的放免測定

根據自動γ計數儀上放免測定的結果顯示：在球囊損傷第3天后損傷動脈組織標本中的TGFα含量為（187.46±105.63）pg/g，而對側正常頸動脈標本中測定的TGFα含量為（89.11±101.87）pg/g，兩組比較其TGFα含量具有統(tǒng)計學意義的差異，P=0.0028＜0.01。

3 討 論

血管成形術術后再狹窄發(fā)生機制主要與中層少數SMCs遷移到內膜不斷增殖，不斷分泌細胞基質有關，而SMCs的表型轉化正是其此后遷移和增殖的啟動環(huán)節(jié)。SMCs在局部環(huán)境的損傷信號調控下可發(fā)生去分化，由收縮表型轉化成胚胎和新生兒期才出現的合成表型，形態(tài)和結構功能上都可發(fā)生了明顯變化[1]。實驗中通過透射電鏡看到SMCs在內膜增生過程中存在這種表型變化特點，與Masakiyo N.的觀察結果一致[2]，而SMCs表型的這種雙向轉化的特點可能也是內膜增生具有一定的自限性、時限性的原因。而中膜厚度的時相性性變化可能與中膜表型轉化SMCs向內膜的遷移有關。

SMCs的表型轉化是其以后遷移和增殖的基礎，而誘導SMCs表型轉化和增生主要與局部的多肽生長因子有關[3]，其中TGFα可能在其中起著重要作用。TGFα多存在于胚胎組織和腫瘤組織中，是組織分化發(fā)育和腫瘤形成過程中重要調控因子，也通常被認為是胚胎組織中EGF受體的主要配基。轉化細胞表面的EGF受體常明顯上調，并與TGFα一起形成促使轉化細胞自主性生長的自分泌環(huán)[3]，現人們已發(fā)現：表型轉化后大量增殖SMCs具有胚胎期細胞的一些特點，而EGF受體數量也明顯增加[4]，同時有學者也發(fā)現高血壓大鼠的血管SMCs中TGFα的表達明顯升高[5]，我們也發(fā)現：內膜損傷后，TGFα在損傷血管局部組織中的含量明顯升高，較正常血管組織增加一倍以上。提示TGFα/EGFR信號通路對PCI術后再狹窄過程中的SMCs的表型轉化和過度增殖可能起著重要的信號調節(jié)作用。

[1] Mugabe BE,Yaghini FA,Song CY,et al.Angiotensin II-induced migration of vascular smooth muscle cells is mediated by p38 mitogen-activated protein kinase-activated c-Src through spleen tyrosine kinase and epidermal growth factor receptor transactivation[J].J Pharmacol Exp Ther,2010,332(1):116-124.

[2] Masakiyo N.,Kimura T.,Ohishi H.,et al..Restenosis after pecutaneous transluminal coronary angioplasty: pathologic observations in 20 patients [J].J.Am.Coll Cardiol,1991,17(2):433-439.

[3] Inoue T,Node K. Molecular basis of restenosis and novel issues of drug-eluting stents [J].Circ J,2009,73(4):615-621.

[4] Freeman EJ,Sheakley ML,Clements RJ.Angiotensin II-dependent growth of vascular smooth muscle cells requires transactivation of the epidermal growth factor receptor via a cytosolic phospholipase A(2)-mediated release of arachidonic acid[J]. Arch Biochem Biophys,2010,498(1):50-56.

[5] 張放鳴,周建新,李渝萍.動脈粥樣硬化血管平滑肌細胞中干細胞因子 mRNA的表達水平增加[J].高血壓雜志 1999,7(4):363-365.

R541.4

B

1671-8194（2013）01-0073-02

湖南省科技廳重點課題項目（No．2009SK2010）和湖南省自然科學基金重點項目（No．11JJ2046）

*通訊作者：