Wnt信號通路與血管再狹窄關系研究進展及藥物干預前景

華軍益 何煜舟

Wnt信號通路與血管再狹窄關系研究進展及藥物干預前景

華軍益 何煜舟

冠脈支架術后再狹窄（restenosis，RS）一直是限制其遠期療效的最大難題，藥物涂層支架的問世將RS率降至10%左右[1]，但并沒有從根本意義上消除RS。深入研究血管損傷后RS的基因調控機制可能是最終解決這個難題的關鍵。

經(jīng)皮冠狀動脈成形術（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）后RS的發(fā)生機制目前尚不十分清楚，如何預防RS仍然是當前心血管病學研究領域所面臨的主要課題之一。目前認為RS形成過程為：球囊擴張對血管壁的直接損傷、血管壁的彈性回縮及血小板的黏附、聚集等始動因素，激發(fā)了血管壁炎癥反應，導致多種炎癥因子、細胞生長因子的釋放，促進原癌基因的異常表達和調節(jié)細胞周期的蛋白質合成，其結果促進血栓形成、細胞增殖和基質堆積導致RS。大多數(shù)學者認為中膜平滑肌細胞（smooth muscle cell,SMC）增生、遷移并分泌大量細胞外基質形成增厚的新生內膜是造成RS的直接原因[1-3]。在這個過程中，SMC通過自分泌、內皮和外膜及血液成分通過旁分泌等形式共同參與了SMC的增殖、遷移和轉型。實驗研究中，利用抑制SMC增殖的某些藥物可減輕血管成形術后RS的程度。需要指出的是：血管平滑肌細胞（vascular SMC,VSMC）和成纖維細胞的增殖和分泌細胞外基質(extracellularmatrix, ECM)是造成血管內膜增厚的最重要原因，另外還包括了內皮細胞、血小板和血細胞，成纖維細胞等多種細胞復雜的共同作用促成了血管RS。

Wnt是一組分泌型糖蛋白家族，哺乳動物有19個Wnt蛋白、10個Fzd受體、2個Lrp輔助受體。Wnt信號通路是一條在生物進化過程中極為保守的通路，在正常生長發(fā)育中起關鍵作用。Wnt作用機制有兩種：經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路。近年有研究[4]認為每個Wnt蛋白既可激活經(jīng)典通路也可激活非經(jīng)典通路，取決于細胞表面的Wnt-Fzd結合物的特異性。經(jīng)典Wnt通路即Wnt/βcatenin信號通路，常見且研究較為透徹。在沒有Wnt信號刺激的情況下，結直腸腺瘤性息肉（adenomatous polyposis coli,APC）基因產(chǎn)物、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、軸蛋白和轉導蛋白（anxin or conductin）構成降解復合體將β連環(huán)蛋白磷酸化，進而與泛素蛋白（ubiquition,Ub）結合被泛素化降解，胞質內β-catenin維持低水平從而維持細胞的穩(wěn)態(tài)。當細胞分泌的Wnt蛋白與細胞跨膜受體特異受體卷曲蛋白（frizzle,Frz）及輔助受體低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（LRP5/6）結合后，活化細胞內DVL-1蛋白，抑制胞質內β-catenin與Axin-APC-GSK-3β等形成降解復合物，導致β-catenin在細胞質內積累并轉移至核內，與核內轉錄因子T細胞因子（TCF）/淋巴樣增強因子（LEF）相結合，啟動靶基因c-myc、cyclin D1等轉錄，從而調控細胞生長。已經(jīng)有很多研究表明Wnt信號通路參與了某些實體腫瘤和血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。近年來有研究提示W(wǎng)nt信號通路參與調節(jié)VSMC的發(fā)育以及損傷后的增殖；也有研究[5]發(fā)現(xiàn)大鼠頸動脈受損后Wnt通路的某些信號分子高表達，這些提示W(wǎng)nt信號通路可能在球囊損傷后血管RS中起作用，尤其可能參與調控了中膜SMC增殖、遷移和內膜新生過程；Wnt信號通路有可能成為抗血管RS新治療的靶點。

1 Wnt信號通路和血管內皮在RS中的作用

內皮細胞是一層連續(xù)覆蓋于整個血管腔表面的扁平細胞，是血管基底膜的重要組成部分，是血液與血管壁和組織之間的物理屏障，能夠合成和分泌NO、PDGF、ET-1、FGF等多種活性因子。內皮損傷是引起RS的始動因素，內皮細胞受損后NO和PGI的分泌減少，炎癥細胞浸潤，抗血小板聚集和抗增殖作用減弱，VSMC在內皮缺失的部位移行和過度增殖[6]。球囊損傷后內皮功能障礙與血管重塑關系密切。

在內皮細胞培養(yǎng)中，Wnt1和Wnt3a可以刺激內皮細胞的增殖，同時誘導了下游β-catenin/LEF/TCF的表達增多[7-8]。在體實驗也觀察到心肌梗死后梗死區(qū)的血管發(fā)生中，β-catenin的定位從內皮細胞的胞膜轉移到胞質中同時伴DVL-1表達增加[9]，表明Wnt-frizzled信號通路參與了血管內皮細胞的增殖調控。在血管損傷后愈合過程中，內皮細胞的Wnt信號通路被激活，一方面可能通過自分泌方式促進損傷血管內皮化，對創(chuàng)傷起到積極的修復作用。另一方面，也可能通過旁分泌方式（分泌Wnt蛋白）作用于中膜SMC，影響其增殖、移行。

2 Wnt信號通路和VSMC在血管重構中作用

血管中膜SMC增殖、遷移并分泌大量細胞外基質是動脈粥樣硬化和損傷后RS形成的核心病理過程，最終使新生內膜形成、血管壁增厚。相對于主動脈來說，冠狀動脈和頸動脈屬于中動脈，中動脈的中膜主要由SMC組成，推測這可能是PTCA術后冠狀動脈和頸動脈容易發(fā)生RS的解剖特點。深入研究VSMC增殖、移行的調控機制是最終解決RS難題的必經(jīng)之路。

在血管RS過程中，SMC通過自分泌、內皮和外膜及血液成分通過旁分泌等形式共同參與了SMC的增生遷移和轉型。因此，RS過程是多種細胞和血液成分通過眾多細胞因子、炎癥因子以及信號通路間復雜的交互網(wǎng)絡共同作用而形成。

PTCA術后血管內膜被撕脫，內皮下基質和膠原暴露，內皮細胞產(chǎn)生ET-1、VEGF、黏附因子和血管緊張素轉化酶等多種血管活性分子，中膜SMC在多種生長因子和血管活性物質的刺激下被激活并不斷增殖[6]，局部激活因子表達增強并活化金屬基質蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs），降解成份復雜結構致密的ECM，使中膜SMC得以遷移到內膜層[6,10]。已有文獻報道[11]，血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）可以通過TGF-β/ Smad信號途徑促進SMC的增殖和膠原合成。在粥樣硬化斑塊和血管RS的部位，TGF-β和Smad基因表達及活性明顯增高并延續(xù)至ECM形成的全過程[12-13]。

筆者在離體和在體兩個水平證實了Wnt信號通路參與調控了VSMC增殖和膠原合成。用AngⅡ刺激VSMC增殖，檢測到Wnt4/DVL-1/β-catenin高表達，以SiRNA技術阻斷Wnt通路可以抑制AngⅡ對VSMC的促增殖作用。與Tsaousi等[14]最新研究結果相一致；同時在球囊損傷的大鼠頸動脈檢測到Wnt4/DVL-1/βcatenin信號分子表達增加，而Wang等[5]研究顯示大鼠頸動脈受損傷后β-catenin/TCF信號激活，兩個結果結合起來，說明Wnt經(jīng)典通路參與血管RS病理過程調控。Chen等[15]研究指出DVL-1可能對心肌梗死后成纖維細胞和血管內皮細胞增殖、移行有影響，對心肌梗死損傷后修復起重要作用。筆者在離體細胞和在體動物實驗中也發(fā)現(xiàn)增殖狀態(tài)下的VSMC和血管損傷后重構的內中外膜均存在dvl-1 mRNA和蛋白水平高表達，推測DVL-1可能對血管損傷后重構過程中包括SMC、成纖維細胞在內的多種細胞激活、增殖和分泌ECM都有作用。

3 Wnt信號通路在血管重構中ECM形成和降解中的作用

AngⅡ可以通過TGF-β/Smad信號途徑促進SMC的增殖和膠原合成[12-13]。Rodrigues等[16]認為AngⅡ可以不依賴TGF-β直接激活VSMC的Smad通路，促進血管內膜膠原合成。筆者的研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ可以通過Wnt經(jīng)典信號途徑促進SMC的增殖和膠原合成，Wnt信號通路和TGF-β/Smad信號途徑有何交互聯(lián)系,AngⅡ可以直接激活以上兩個信號通路還是先激活其中一個信號途徑，進一步通過信號途徑間的交互聯(lián)系使另外一個途徑激活，值得進一步研究。

Wu等[17]離體研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin/TCF/LEF通路可以直接作用MMPs的啟動子，使MMP表達增加降解ECM，便于T細胞通過基底膜移行，首次揭示了Wnt通路對MMP家族有直接作用。這個結果使筆者聯(lián)想到在血管損傷RS過程中Wnt信號激活，使MMPs表達增加，可能有助于中膜VSMC通過被降解的ECM移行至內膜。筆者的實驗表明，Wnt信號通路的激活在AngⅡ刺激VSMC合成膠原過程中起作用。這與Wu的研究看似矛盾，其實不然，Wnt經(jīng)典通路的激活一方面促進中膜SMC周圍的ECM降解利于其移行，另一方面促進已經(jīng)移行至內膜的SMC增殖和合成膠原。這是否意味著Wnt經(jīng)典通路對血管重構過程中ECM的降解、合成具有雙向調控作用？如果這種雙向調控作用確實存在，就可以解釋為什么動脈RS僅僅是內膜增厚而中膜變化不明顯，即Wnt信號在中膜主要與ECM降解和SMC移行有關，當VSMC移行至內膜后，Wnt信號主要參與了其大量增殖和分泌ECM，ECM在內膜的合成遠大于降解導致內膜增厚。

Wnt信號通路可以調控成纖維細胞增殖以及心臟重構過程中內皮間充質轉化[18-19]，Chen等[15]研究指出DVL-1可能對心肌梗死后成纖維細胞增殖、移行有影響，對梗死后心臟重構起重要作用。筆者在離體細胞和動物在體實驗中也發(fā)現(xiàn)增殖狀態(tài)下的VSMC和血管損傷后重構的內中外膜均存在dvl-1 mRNA和蛋白水平高表達，推測DVL-1可能對血管損傷后重構過程中成纖維細胞增殖、分泌ECM有作用。血管外膜以大量成纖維細胞為主，當血管受損傷時，成纖維細胞具有修復外膜的能力。目前認為外膜成纖維細胞涉及血管損傷后RS過程，事實上對血管損傷反應活躍的這種非肌性細胞僅少量存在于中膜，絕大部分分布在外膜，且具有增殖、遷移、黏附、表達n-SM actin及合成細胞外基質蛋白的能力。也就是說，在某些刺激因子作用下，成纖維細胞的表型可以轉變?yōu)榧〕衫w維細胞，表達α-肌動蛋白，并從外膜遷移至內膜。當血管外膜受損，即便血管內皮正常，同樣會出現(xiàn)動脈粥樣硬化病變，均提示血管壁外膜參與了血管RS過程[20]。深入研究Wnt信號通路對外膜成纖維細胞的調控作用對揭示血管RS機制和尋求有效干預措施非常重要。

4 藥物預防血管RS

血管重構一旦形成，目前還沒有使其逆轉的有效方法，所以血管RS仍是以預防為主。目前研究已發(fā)現(xiàn)某些西藥和中藥對預防RS可能有效。

4.1 他汀類 目前認為是最有效的預防PCI術后血管RS的藥物之一。他汀預防血管RS與其調脂外作用關系密切。包括抗炎、抗氧化應激、抗增殖、保護內皮、抑制泡沫細胞形成等。但其預防血管RS的分子機制尚未完全研究透徹。阿托伐他汀可以通過抑制AngⅡ誘導的人腸系膜動脈VSMC NADPH氧化酶-活性氧通路，從而抑制SMC的增殖[21]。Chan等[22]研究指出辛伐他汀可以通過抑制細胞周期依賴的激酶抑制劑（CDKI）和p53途徑，抑制對葡萄糖刺激的主動脈SMC的增殖。也有研究指出，阿托伐他汀抑制高血壓誘導的血管重構與其抗氧化特性直接相關[23]。筆者在實驗中發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可以通過下調Wnt經(jīng)典通路抑制VSMC的增殖和ECM合成，但很可能不是唯一途徑。

4.2 細胞有絲分裂抑制劑 如雷帕霉素、紫杉醇等，已經(jīng)被廣泛應用于藥物洗脫支架并大大降低了PCI術后RS率。這類藥物可以在支架局部抑制SMC增殖從而減輕內膜反應性增厚，但這類藥物同樣也抑制了血管損傷處內皮的生長導致支架內皮化延遲，有增加支架內血栓形成的風險。

4.3 中藥 中藥預防PTCA術后RS的研究雖起步較晚，但實驗研究表明其可作用于RS的多個病理環(huán)節(jié)，臨床觀察亦證明有一定效果，值得深入研究和開發(fā)。許多具有活血化瘀功效的中藥如川芎嗪、丹參、三七總皂甙等被證實有抑制VSMC增殖的作用[24-25]。川芎嗪可以下調RS部位VSMC的成纖維細胞生長因子mRNA、原癌基因c-myc mRNA表達，上調抑癌基因p53 mRNA、內皮衍化舒張因子mRNA表達，說明川芎嗪抑制內膜增殖可能與調節(jié)VSMC增殖相關基因表達有關系[26]。也有研究顯示川芎嗪、葛根素等可以抑制VSMC合成膠原[27-28]。某些具有抗炎作用的中藥，如大黃素、穿心蓮成分API0134等對RS的預防亦顯示出一定的作用[29-30]。發(fā)現(xiàn)大黃素可抑制正常動脈、硬化動脈及球囊損傷動脈壁的SMC增殖，主要機制為抑制細胞由G0期向S期轉化。筆者研究顯示大黃素對正常生長的VSMC抑制作用不明顯，對增殖狀態(tài)的VSMC有明顯抑制作用，其機制與下調Wnt信號有關，其抗炎作用和下調Wnt通路之間可能存在的關聯(lián)尚不清楚。某些具有抗血小板、抗凝作用的中藥如水蛭素、去纖酶也被證實能夠抑制內膜增殖[31]。

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2013-02-27）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省衛(wèi)生廳科研基金（2010KYA155）；浙江省中醫(yī)藥科學研究基金（2011ZA027）

310006 杭州，浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院心血管科

華軍益，E-mail：huajunyi1973@163.com