病毒性腦炎診斷技術(shù)的進(jìn)展

黃藝婧 徐平

1 腦脊液（CSF）檢查 CSF檢查在VE診斷中是一種常規(guī)輔助檢查方法，在與其他腦炎鑒別中至關(guān)重要。除有明確腰穿禁忌證外，臨床懷疑腦炎者均應(yīng)行腰穿查CSF。

1.1 細(xì)胞計(jì)數(shù) 根據(jù)福克斯羅森塔爾計(jì)數(shù)室研究［1］，為避免細(xì)胞過多裂解，總細(xì)胞計(jì)數(shù)與白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在CSF采集后2h內(nèi)進(jìn)行。成年人VE的典型CSF特點(diǎn)為白細(xì)胞正常或輕度增高，白細(xì)胞計(jì)數(shù)為（50～500）×106／L，偶見＞1000×106／L，其中以淋巴細(xì)胞增多最為顯著。嬰兒VE白細(xì)胞計(jì)數(shù)多無(wú)固定值，其隨著年齡增加逐漸增大［2］。在感染急性期白細(xì)胞增高以中性粒細(xì)胞為主，但因就診時(shí)常已錯(cuò)過此期而臨床上少見。部分單純皰疹病毒性腦炎（herpes simplex virus encephalitis，HSE）急性感染期白細(xì)胞數(shù)多在正常范圍，之后逐漸升高。腸病毒感染所致VE的CSF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)早期亦可正常，之后數(shù)天內(nèi)逐步上升。

1.2 糖及氯化物 VE患者CSF中糖和氯化物一般正常，但巨細(xì)胞病毒（CMV）、西尼羅河病毒、皰疹病毒等少數(shù)病毒感染時(shí)糖含量可減少。

1.3 蛋白質(zhì) VE患者的CSF中蛋白質(zhì)水平在正常范圍或輕度升高，但一般不超過0.5～1.0g／L。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 如果條件允許，應(yīng)常規(guī)進(jìn)行CSF細(xì)胞培養(yǎng)，以確定病毒株。此法敏感性低，特異性高，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，故在臨床上診斷VE時(shí)應(yīng)結(jié)合其他相關(guān)檢查綜合考慮。也可在適當(dāng)時(shí)間取咽拭子、糞便及水皰中的液體或病變拭子進(jìn)行培養(yǎng)，但這些取材和CSF中細(xì)胞含量較少，很難達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)的要求，故臨床上很少應(yīng)用。

2 腦電圖（electroencephalogram，EEG） EEG是診斷本病的重要依據(jù)之一。它是腦實(shí)質(zhì)受累的指標(biāo)，可顯示大腦早期病變，通常在影像學(xué)檢查顯示腦實(shí)質(zhì)病變前就能出現(xiàn)異常信號(hào)，通過EEG可觀察到大腦局部異常，但其特異性不高。如EEG頻率變慢（常為4～9Hz）并出現(xiàn)陣發(fā)性慢波、尖波或棘波，則提示病情較重。

3 病原學(xué)檢查

3.1 病毒分離 此方法目前被認(rèn)為是VE病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，其優(yōu)點(diǎn)是特異性高，但操作過程復(fù)雜，成功率低，且需要患者的配合與理解，臨床很難普及。

3.2 病毒特異性抗體檢測(cè) 單純皰疹病毒1、2型（HSV-1、HSV-2），水痘病毒（VZV），CMV，人類皰疹病毒6、7型（HHV-6、HHV-7），EB 病 毒 （EBV），呼 吸 道 合 胞 病 毒（RSV），人類免疫缺陷病毒（HIV），腺病毒（adenovirus），流感病毒 A、B（influenza virus A、influenza virus B），輪狀病毒（rotavirus），柯 薩 奇 病 毒 （coxsachie virus）和 副 流 感 病 毒（parainfluenza virus）均可通過酶免疫測(cè)定（enzyme immunoassay，EIA）在血清和CSF中被檢測(cè)到［3］。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）用于檢測(cè)病毒抗體，成功率較高。但該實(shí)驗(yàn)抗體常為重組蛋白，常因受細(xì)菌污染而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。隨著ELISA方法的改良，其檢測(cè)敏感性有所提高，可以用于大規(guī)模血清學(xué)篩查。

蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）在多種病毒感染性疾病的診斷中被作為確診實(shí)驗(yàn)，并用于識(shí)別血清和CSF中的特異性抗體。因其抗原敏感性低于新一代ELISA檢測(cè)病毒抗體，故在VE診斷中未成為首選診斷技術(shù)。

3.3 病毒抗原檢測(cè) HSV，VZV，RSV，流感病毒 A、B，副流感病毒1、3以及腺病毒的抗原均可通過傳統(tǒng)的免疫熒光（IF）法對(duì)其咽拭子標(biāo)本進(jìn)行抗原檢測(cè)。但此方法不適用于CSF標(biāo)本，因?yàn)镃SF中抗原含量較低，很難被檢出。

免疫組織化學(xué)（IHC）是檢測(cè)組織中抗原的常用方法，廣泛應(yīng)用于定性實(shí)驗(yàn)，可通過顯微鏡直觀的看到組織中是否存在相關(guān)抗原，其效果穩(wěn)定。

新型ELISA方法基于雙抗體夾心模式，也可應(yīng)用于病毒檢測(cè)。2001年Bode等［4］報(bào)道用該方法檢測(cè)博爾納病病毒（Borna disease virus，BDV）的磷蛋 白（p24）和核蛋 白（p40）的構(gòu)象表位。該方法檢測(cè)BDV抗原具有較高敏感性和特異性，并保持了ELISA法的高穩(wěn)定性、操作方便的優(yōu)點(diǎn)，也可以試用于檢測(cè)其他病毒 。

3.4 聯(lián)合檢測(cè) 三聯(lián)-ELISA檢測(cè)即特異性循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC）、相關(guān)游離抗體和血漿抗原的檢測(cè)。Bode等［4］的研究揭示BDV-CIC、相關(guān)游離抗體和血漿抗原（p40／p24）檢測(cè)相同樣本陽(yáng)性率的差異。該研究發(fā)現(xiàn)檢測(cè)CIC陽(yáng)性率明顯高于抗體和抗原的陽(yáng)性率，表明此病毒在機(jī)體內(nèi)通過抗原－抗體免疫反應(yīng)后大多形成CIC，以CIC形式引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，這可能也解釋了BDV持續(xù)感染的免疫機(jī)制。此方法檢測(cè)感染陽(yáng)性率比單純血清學(xué)檢測(cè)高10倍以上［5］，可能是現(xiàn)代病原學(xué)診斷的一個(gè)新趨勢(shì)。

4 基因組學(xué)診斷 基因組學(xué)在病毒性疾病的研究和診斷中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，為診斷VE開辟了傳統(tǒng)病原學(xué)診斷方法以外的新途徑，特別是聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的高敏感性和高特異性，使VE的診斷技術(shù)有更大的進(jìn)步?；蛟\斷是利用DNA分析技術(shù)，直接從基因水平（DNA或RNA）檢測(cè)患者的基因缺陷。2011年福建省對(duì)引起VE的腸道病毒Echo30進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）序列分析鑒定Echo30血清型，測(cè)定并分析其擴(kuò)增產(chǎn)物的序列。結(jié)果顯示其擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與不同地區(qū)、時(shí)間的流行株的基因序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)3個(gè)位點(diǎn)氨基酸出現(xiàn)了變異［6］。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）的＋405G／C位點(diǎn)多態(tài)性與VE的易感性有關(guān)［7］。PCR技術(shù)是最便捷的核酸檢測(cè)方法。隨著其應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，實(shí)驗(yàn)種類從最初的RT-PCR增加到與其他各項(xiàng)技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的巢式反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR（FQ-nRT-PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（real-time quantitative PCR）、多重 RTPCR（multiplex PCR）等多種方法。

PCR是擴(kuò)增DNA的方法之一，用于RNA檢測(cè)時(shí)需先將RNA轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的DNA。常規(guī)RT-PCR分反轉(zhuǎn)錄和cDNA擴(kuò)增兩個(gè)步驟進(jìn)行，一步法RT-PCR則是在RTPCR基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)，該方法在同一反應(yīng)體系中，同時(shí)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)，從樣品RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增到電泳觀察的全部過程可在短時(shí)間內(nèi)完成，并且可以精確、快捷地?cái)U(kuò)增出目的片段，適合大規(guī)模推廣。但檢測(cè)時(shí)要注意反應(yīng)溫度，較低溫度可使RNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)而降低RT-PCR檢測(cè)率。

FQ-nRT-PCR技術(shù)檢測(cè)病毒基因片段具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如特異性高、靈敏性高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便和快捷等。它克服了RT-PCR只能定性不能定量、容易污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性、需通過電泳觀察結(jié)果以及溴化乙啶對(duì)人體有害等缺點(diǎn)。此外，其在病毒復(fù)制水平及抗病毒治療療效評(píng)估方面具有重要臨床價(jià)值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR以敏感性高、特異性高、污染少、可定量等優(yōu)點(diǎn)著稱，其中目前常用于檢測(cè)各種病毒主要有Taq Man探針法和SYBR GreenⅠ染料法。SYBR GreenⅠ是一種雙鏈DNA結(jié)合染料，它結(jié)合到雙鏈DNA后可使其熒光強(qiáng)度增加1000倍以上［8］，從而保證熒光信號(hào)增加與PCR產(chǎn)物增加同步。Taq Man real-time PCR優(yōu)勢(shì)在于利用上、下游引物及與目的模板互補(bǔ)的探針使反應(yīng)特異性具有雙重保證，克服了SYBR GreenⅠ法存在假陽(yáng)性的缺陷，從而使檢測(cè)結(jié)果更加可靠。

5 影像學(xué)檢查 影像學(xué)檢查是VE診斷的重要輔助手段。它能夠及早發(fā)現(xiàn)VE病灶及其侵犯范圍，為早期診斷和治療提供直觀依據(jù)。目前常用的影像學(xué)檢查方法主要是MRI和CT。MRI準(zhǔn)確率及敏感性較CT高，但MRI要求患者高度配合，偶爾的抽動(dòng)都會(huì)對(duì)影像質(zhì)量產(chǎn)生較大影響，因此對(duì)于不易控制抽動(dòng)的小兒，CT是首選檢查。

VE的好發(fā)部位主要是額、顳、枕葉的近皮層區(qū)，有時(shí)可同時(shí)累及灰白質(zhì)。CT檢查主要表現(xiàn)為病變區(qū)平掃呈低密度灶，MRI主要表現(xiàn)為病變區(qū)的長(zhǎng)T1及長(zhǎng)T2信號(hào)。增強(qiáng)掃描CT與MRI均為呈線狀及條片狀強(qiáng)化居多。治療后如強(qiáng)化的區(qū)域減少，則提示病情好轉(zhuǎn)。近年來(lái)，MRI擴(kuò)散加權(quán)成像（diffusiong weighted imaging，DWI）、磁共振波譜（1H MRS）和磁敏感加權(quán)成像（SWI）的應(yīng)用對(duì) VE診斷提供了更多依據(jù)。Sawlani［9］曾對(duì)45例確診VE患者行DWI檢查，結(jié)果顯示在VE急性期表現(xiàn)為病灶范圍和異常彌散程度的多樣性，且均表現(xiàn)為高信號(hào)。

總之，通過樣本檢測(cè)抗原、抗體和免疫復(fù)合物為VE提供了診斷依據(jù)，通過分子生物學(xué)技術(shù)在CSF和血液中檢測(cè)病毒的應(yīng)用，為VE提供了病原學(xué)依據(jù)。另外，多重分析、基因芯片和微流體技術(shù)的廣泛使用，也可能為未來(lái)診斷VE提供更簡(jiǎn)便的方法。盡管如此，VE的病原學(xué)與基因組學(xué)診斷仍然充滿挑戰(zhàn)。希望今后能出現(xiàn)更有效的病原學(xué)診斷方法，以更好的明確診斷。

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