肉鴿大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性的研究

柏文芳，伍清林，金蘭梅＊，陳玉華

（1.金陵科技學院動物科學與技術(shù)學院，江蘇南京210038；2.南京市江寧區(qū)湯山街道動物疫病防治站，江蘇南京211131）

近年來，隨著農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，養(yǎng)鴿業(yè)得到了蓬勃發(fā)展，由散養(yǎng)發(fā)展到目前的規(guī)模飼養(yǎng)，因而，隨著飼養(yǎng)數(shù)量增加和方式的改變，疾病的發(fā)生也較以前更為頻繁和復雜。大腸桿菌病已經(jīng)成為肉鴿重要的、常見的細菌性傳染病之一［1］。在一些大型和個體肉鴿場中，由于環(huán)境衛(wèi)生條件較差，時常發(fā)生大腸桿菌病，由于大腸桿菌血清型較多，且各鴿場流行菌株不同，往往給本病的免疫預(yù)防帶來許多困難。此外，由于臨床上缺乏檢測條件，生產(chǎn)上盲目濫用藥物，造成耐藥菌株不斷產(chǎn)生，致使對大腸桿菌病治療效果下降，給養(yǎng)鴿業(yè)造成嚴重了經(jīng)濟損失。筆者對南京市郊某肉鴿飼養(yǎng)場在2011年9月肉鴿發(fā)生的大腸桿菌病，進行了病理剖檢、病原分離鑒定及藥物敏感性試驗，為肉鴿規(guī)模化鴿場和養(yǎng)殖戶在肉鴿生產(chǎn)中對大腸桿菌病的防治提供科學的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 鴿場飼養(yǎng)情況

鴿場地處長江岸邊，遠離居民區(qū)，無噪音源。內(nèi)有8棟鴿舍，呈東西排列，籠養(yǎng)，水泥地面，籠架排列緊密，通風不良，濕度高，飼養(yǎng)有近5 000 只肉鴿。以玉米為主飼料，糞便2～3周清理一次，每周消毒一次。按正常的免疫程序進行新城疫等疫病預(yù)防。

1.2 培養(yǎng)基、試劑、藥敏紙片等

營養(yǎng)瓊脂（NA）、麥康凱瓊脂（MAC），購于國藥集團化學試劑有限公司，批號分別為20100115、20090525；S.S 瓊脂、營養(yǎng)肉湯、伊紅美藍瓊脂（EMB）、三塘鐵瓊脂（TSI）、腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管GYZ－15e、靛基質(zhì)試劑，均購于杭州天和微生物試劑有限公司，批號分別為100915、100908、100907、100806、110222、110223；血瓊脂培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制（采用營養(yǎng)瓊脂與綿羊鮮血5%混合）；卡那霉素、復方新諾明、阿米卡星、頭孢曲松、諾氟沙星、強力霉素、先鋒必、多粘菌素、呋喃妥因等18種藥敏紙片，購于杭州天和微生物試劑有限公司，批號100823；質(zhì)控菌大腸埃希氏菌ATCC25922、大腸桿菌O 因子血清等購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 試驗方法

1.3.1 觀察臨床癥狀和剖檢 按照傳染病規(guī)范要求，采用常規(guī)的方法進行流行病學調(diào)查和臨床癥狀觀察，選擇不同年齡的病鴿和死鴿進行解剖，觀察病理變化。

1.3.2 細菌分離培養(yǎng) 在解剖病鴿的同時，無菌采集心血、腹水抹片，取心臟、肝臟和脾等病變組織，剪開內(nèi)切面觸片進行革蘭氏染色，區(qū)別陽性和陰性細菌；同時分別涂布NA 平板、MAC 平板和血瓊脂平板，置37℃培養(yǎng)24h，觀察各種培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)特征。然后挑取MAC平板上單個紅色的典型菌落再次接種到MAC平板上，37℃培養(yǎng)24h分離純化，后再挑取單個典型菌落分別轉(zhuǎn)接到EMB 平板和TSI斜面上，37℃培養(yǎng)24h，初步鑒定為大腸桿菌。分別挑取TSI斜面上的單個菌落，接種到營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)24h，獲得純培養(yǎng)物，進行生化鑒定。同時另挑選單個菌落涂片革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)和染色特征。

1.3.3 生化鑒定 按細菌常規(guī)生化特性試驗方法進行生化試驗。選取麥康凱瓊脂上長的紅色菌落或伊紅美蘭瓊脂上生長出的黑色帶有金屬光澤的菌落，作靛基質(zhì)、三糖鐵、明膠液化、氧化酶、過氧化氫酶、尿素酶、MR、V－P 及糖（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖）發(fā)酵試驗，觀察反應(yīng)結(jié)果，確認菌株是否為大腸桿菌。并用標準菌株作參照。

1.3.4 血清型鑒定 將純化的大腸桿菌分別接種于NA 平板，37℃培養(yǎng)24h后，用0.5%的滅菌石炭酸生理鹽水5mL 沖洗，收集菌懸液放入滅菌的試管中，121℃高壓滅菌2h，冷至室溫，按中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供的使用說明書進行抗原抗體平板凝集試驗，鑒定血清型。

1.3.5 動物回歸試驗 將鑒定為大腸桿菌的菌株接種于營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)18h。經(jīng)細菌計數(shù)用生理鹽水稀釋成1.0×107CFU／mL 的菌液，按0.5mL／只頸部皮下注射20～25日齡的雛鴿（一個菌株注射一只），另取2只同齡雛鴿作為對照組，0.5 mL／只注射無菌肉湯。觀察其發(fā)病和死亡情況，剖檢觀察病變，并進行細菌分離，對比菌落形態(tài)和生化特性［1］。

1.3.6 藥敏試驗 按照世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的Kirby Bauer藥敏紙片擴散法，將各株大腸桿菌的純培養(yǎng)物均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，貼上慶大霉素等18種藥敏紙片，37℃培養(yǎng)24h觀察，量取抑菌圈的直徑。依據(jù)NCCLS 有關(guān)標準，以質(zhì)控菌ATCC25922為對照進行測定，只有當質(zhì)控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內(nèi)測試菌株結(jié)果才有效。判定標準參照美國國家臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）M100－S15［2］以敏感、中介、耐藥3 種形式對抑菌圈大小作出判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀與病變

該肉鴿場鴿群每年在天氣驟然變化時均要發(fā)生拉黃白色或黃綠色水樣稀糞為主的癥狀傳染病，使用強力霉素、環(huán)丙沙星、敵菌凈等藥物進行治療，疫情雖然能得到控制，沒有發(fā)生大批死亡，但常年零星發(fā)生。從2011年8月下旬到9月初出現(xiàn)死亡增多現(xiàn)象，以成年鴿為主，也有青年鴿和乳鴿。發(fā)病率增加到15%左右，死亡率增加到5%。病鴿表現(xiàn)為精神沉郁，呆立嗜睡，不愿走動，羽毛松亂，食欲減退或廢絕，呼吸困難，張口呼吸，拉黃白色或黃綠色水樣稀糞，肛門周圍被糞便污染，極度衰竭和消瘦，個別嚴重腹瀉的病鴿后期出現(xiàn)頭部側(cè)歪抽搐死亡。

共剖檢14 只病死鴿，剖檢變化為病鴿體腔積液，呈灰黃色混濁，接觸空氣后凝固；心臟呈纖維素性心包炎病變，心包膜明顯增厚，不透明，包膜上的纖維素呈絨毛狀，心包積有淡黃色液體，接觸空氣易凝固，心室擴張，心壁變薄，質(zhì)地柔軟，心室內(nèi)有大量積血；肝腫大、淤血，肝包膜增厚，表面被覆大量黃白色的纖維素膜凝塊，易剝脫，被膜下散在大小不等的出血點，肝呈紫褐色；小腸見卡他性炎癥，眼觀可見黏膜充血、潮紅、腫脹，表面附著多量滲出物。

2.2 細菌分離

在肉湯培養(yǎng)基37 ℃24h培養(yǎng)后，呈均勻混濁，管底有淡白色粘稠沉淀，管壁液面有菌環(huán)；在MAC平板上，形成中等大小的紅色菌落；在NA 平板上長出表面光滑、濕潤、半透明、灰白色、圓形微凸起、中等大的菌落；在血平板上長出菌落較大，邊緣整齊，并有隆起的灰白色菌落，多數(shù)不溶血；在EMB 平板上，形成帶有金屬光澤的黑色小菌落。取心血、腹水抹片、心臟、肝臟和脾等病變組織觸片及培養(yǎng)物涂片染色鏡檢均可見兩端鈍圓，多數(shù)散在排列，革蘭氏陰性短桿菌。

2.3 生化特性

從病死鴿體內(nèi)分離的14 個分離株，經(jīng)生化鑒定，均符合大腸桿菌的生化特征，能在三糖鐵培養(yǎng)基上產(chǎn)酸產(chǎn)氣使培養(yǎng)基變黃，均不產(chǎn)生H2S。對大多數(shù)糖類（乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、果糖）產(chǎn)酸產(chǎn)氣，吲哚試驗、MR 試驗為陽性，V－P試驗、明膠液化試驗、尿素酶試驗、氧化酶試驗陰性，產(chǎn)生靛基質(zhì)，MR 試驗、過氧化氫酶試驗陽性。以上試驗證明此菌是大腸桿菌。

2.4 血清型鑒定

鑒定出的14株大腸桿菌定型其中12 株（2 株未定型）O 血清型共4 種。分別是O2、O18、O78、O101，其中O2型8株，O78型2株，O101型、O18各1株，O2為主要血清型，占血清型總數(shù)的66.67%。

2.5 動物回歸試驗

對照組的2只鴿無任何臨床癥狀，撲殺后剖檢，臟器無任何病變，未分離到細菌。14只注射菌液的肉鴿主要表現(xiàn)為精神不振，縮頭呆立，不愿活動，排土黃色稀糞便。第1d死亡8只，第2d死亡4只，兩天累計死亡12只，死亡率85.71%（12／14）；剖檢可觀察到心包積液，心包膜、心外膜有大量纖維蛋白沉著，氣囊表面有大量黃白色干酪樣滲出物，肝臟腫大，有針尖樣出血斑。從死亡鴿的心血和肝臟組織中分離到細菌，與接種菌比較發(fā)現(xiàn)，菌落形態(tài)相同，生化特性也一致。

2.6 藥敏試驗

分離得到的14株大腸桿菌均對慶大霉素高度敏感（高敏率達100%），對卡那霉素、頭孢拉定、頭孢曲松、先鋒必等高敏率在70%以上；對阿米卡星、呋喃妥因的敏感率在64%以上；對氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、多粘菌素的敏感率和耐藥率均為50%；對紅霉素、鏈霉素、四環(huán)素、復方新諾明、氨芐西林耐藥，耐藥率在57.14%～85.71%之間；對強力霉素、新霉素不敏感。結(jié)果見表1、表2。

表1 14株大腸埃希菌對18種抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果Table 1 The results of 18drug sensititivity tests to 14pathogenic E.coli strains mm

表2 14株分離菌的藥敏試驗結(jié)果Table 2 The results of drug sensititivity tests to 14strains pathogenic E.coli

3 討論與小結(jié)

本次試驗經(jīng)病原分離鑒定為大腸桿菌病。從病鴿體內(nèi)分離到14株大腸桿菌，通過血清型鑒定共確定12 株，分為4 個血清型，分別是O2、O18、O78、O101，其中O28 株為主要血清型，占血清型總數(shù)的66.67%。定型的12株大腸桿菌毒力較強，從動物回歸試驗結(jié)果看，可使雛鴿發(fā)病率達100%，致死率100%。血清型未定的2株大腸桿菌無致病性。

大腸桿菌作為腸道常在菌，在條件變差及其他病原感染后易繼發(fā)致病，并且其血清型眾多、抗原復雜、容易形成耐藥性，在實際生產(chǎn)中疫苗預(yù)防和藥物防治效果不理想。目前我國畜禽大腸桿菌耐藥性嚴重而復雜，對大多數(shù)抗菌藥物都已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性［3］。本試驗在病鴿體內(nèi)分離的14株大腸桿菌對18種抗微生物藥物除慶大霉素、頭孢拉定、卡那霉素3種以外均產(chǎn)生不同程度的耐藥，對強力霉素和新霉素兩種藥物完全耐藥，說明分離菌株已經(jīng)產(chǎn)生了比較嚴重的耐藥性。其原因是該場鴿子發(fā)病后亂投藥和長期濫用藥，使耐藥菌株出現(xiàn)的也越來越多。提示肉鴿飼養(yǎng)場在疾病防治中要合理用藥用，重視大腸桿菌的耐藥性問題。在臨床治療過程中，首先要進行藥敏試驗，可以選擇幾種比較敏感的藥物合用或交替使用，以減少單一藥物的使用劑量或使用時間，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

大腸桿菌在環(huán)境、飼料、飲水、灰塵中均存在，據(jù)研究鴿舍中灰塵大腸桿菌含量達105～106個／g，灰塵是傳播大腸桿菌病最主要的途徑，封閉飼養(yǎng)的鴿舍內(nèi)，通風不良，加上鴿子飼喂時往往拍飛而產(chǎn)生浮塵，這樣的環(huán)境中易暴發(fā)大腸桿菌病［1］。此次鴿場大腸桿菌病的發(fā)生與其落后的飼養(yǎng)管理方式是分不開的。據(jù)調(diào)查鴿場內(nèi)衛(wèi)生狀況較差，空氣塵埃較多，糞便不及時清除，密度過大通風不暢，加之鴿舍建在臨近河道的地方，舍內(nèi)濕度大，雖然每周消毒一次，但長期使用一種消毒藥，病原菌對此已經(jīng)產(chǎn)生完全耐藥（另有報道），空氣環(huán)境中有大腸桿菌存在，在遇到天氣驟然變化等應(yīng)激因素的影響下，造成本病的發(fā)生。因此，建議鴿場平時要加強飼養(yǎng)管理，應(yīng)從溫度、濕度、環(huán)境衛(wèi)生、消毒等方面采取綜合的生物安全措施，做到以預(yù)防為主。

［1］趙寶華，卜 柱，徐 步，等.肉鴿大腸桿菌的分離與鑒定［J］.經(jīng)濟動物學報，2010，14（4）：226－227.

［2］Kh an A，Dass C，Ramam urthy T，et al.Ant ibiot ic resis tance，virulence gen e，and molecular prof iles of Sh iga toxin producin g Esch eri chia colii solat es f rom diverse s ou rces in calcutta［J］.J Clin Microbiol，2002，40（6）：2009－2015.

［3］伍清林，金蘭梅，周正凱，等.動物園珍禽舍內(nèi)大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性的試驗［J］.中國獸醫(yī)雜志2011，47（9）：24－27.