牛妊娠相關(guān)糖蛋白ELISA對早期妊娠診斷效果的影響

李艷艷，胡建宏，雷 靜，曲立立，趙健玲

(1.西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100；2.寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司，寧夏 銀川 750021；3.新疆阜康市九運街鎮(zhèn)獸醫(yī)站，新疆 阜康 831501)

隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，通過檢測牛奶或血液中牛妊娠相關(guān)糖蛋白(PAG)濃度的變化，能夠用于奶牛的早期妊娠診斷[1]。哺乳動物妊娠時，外周血液中PAG變化可作為母牛是否懷孕的標志。在母牛懷孕時，PAG濃度從妊娠后第15～35 d開始上升，但因血清中不同PAG水平的差異，到妊娠第26～30 d才能將PAG作為可靠的妊娠指標[2]。目前，商業(yè)化檢測PAG對待檢牛影響小，結(jié)果判定標準化，適用于規(guī)模牛場母牛早期妊娠診斷[1]。

為了分析利用牛妊娠相關(guān)糖蛋白檢測奶牛早期妊娠診斷的實際效果，于2012年6～8月對寧夏平吉堡奶牛場273頭配種后28～45 d的荷斯坦奶牛使用基于PAG的商品化試劑盒(IDEXX牛懷孕檢測試劑盒)進行早期孕檢，并在人工授精后75 d進行直腸妊娠診斷確認，分析快速PAG酶聯(lián)免疫法的實際應(yīng)用效果，以期提高奶牛繁殖效率，并為奶牛場進行母牛的早期妊娠診斷提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇發(fā)情配種后28～45 d的黑白花奶牛273頭，采集靜脈血液10 mL，送入實驗室進行快速PAG酶聯(lián)免疫法妊娠診斷。

1.2 試劑

牛懷孕檢測試劑盒由北京愛德士元亨生物科技有限公司提供。批次41169-X961， 有效期至2013年2月28日。

1.3 牛懷孕檢測試劑盒操作步驟及結(jié)果判讀

將待檢血清和牛懷孕檢測試劑盒恢復(fù)到室溫，按照ELISA試劑盒產(chǎn)品說明書要求進行孵育和操作，檢測待檢牛的妊娠狀況，具體結(jié)果詮釋方法為：血清或EDTA血漿 S-N值<0.300，為陰性，表示母?？諔?；血清或EDTA血漿 S-N值≥0.300，為陽性，表示母牛懷孕。

1.4 母牛直腸檢查結(jié)果判定

牛懷孕檢測試劑盒診斷出的陰性(空懷)牛和陽性(懷孕)牛均不予處理，等待配種后75 d進行直腸妊娠診斷確認。自然返情時直腸觸診有卵泡發(fā)育以及75 d直腸觸診未懷孕者確定為空懷牛；75 d直腸妊娠檢查懷孕的母牛確定為懷孕牛。

1.5 結(jié)果分析

在結(jié)果判定中，敏感性為妊娠牛樣品中PAG酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果為陽性的比例；特異性為空懷牛樣品中PAG檢測結(jié)果為陰性的比例。結(jié)果的陽性預(yù)測值為PAG檢測為已孕的牛確定為真實妊娠的比例，結(jié)果的陰性預(yù)測值為PAG檢測為空懷的牛確定為真實為空懷的比例；結(jié)果的準確性為PAG檢測的妊娠狀況(妊娠+空懷)與直腸觸診結(jié)果一致的比例。

1.6 統(tǒng)計分析指標

利用Kappa值對PAG酶聯(lián)免疫法和直腸觸診妊娠診斷結(jié)果進行一致性評價。Kappa值為1表明完全符合，0為完全不符[3]。在比較性試驗中，Kappa值在0.4～0.5之間，說明符合率中等；0.5～0.6說明符合率良好；>0.6說明符合率很高。

2 結(jié)果與分析

在試驗期間，對273頭奶牛分別使用牛妊娠相關(guān)糖蛋白(PAG)ELISA試劑盒和直腸檢查兩種方法進行妊娠檢測，并將得到的結(jié)果進行比對。

利用PAG ELISA試劑盒共檢測出80頭奶牛陰性(空懷)，193頭奶牛陽性(懷孕)。在75 d直腸檢查時發(fā)現(xiàn)，使用PAG ELISA試劑盒檢測為陰性(空懷)的80頭牛全部為空懷。因此，使用牛妊娠相關(guān)糖蛋白(PAG) ELISA試劑盒檢測的陰性預(yù)測值為100%(見表1)。

表1 PAG ELISA試劑盒檢測出的全部空懷牛檢測當日至直腸檢查期間的結(jié)果(n=80)Table 1 The status of nonpregnant cows with a negative PAG ELISA outcome until detection by rectal palpation(n=80)

*自然返情直檢有卵泡發(fā)育的牛只判定為空懷。

*Cows diagnosed as nonpregnant based on return to estrus and follicular development by rectal palpation.

PAG ELISA試劑盒檢測為陽性(懷孕)的193頭牛中，75 d直腸檢查時發(fā)現(xiàn)其中的167頭已孕，而26頭為空懷，有返情表現(xiàn)的牛平均返情時間為49.5 d，懷疑這26頭牛早期胚胎死亡或者流產(chǎn)。為了分析PAG ELISA試劑盒檢測結(jié)果的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準確性，建立了2×2列聯(lián)表(見表2)，并在表3中列出了以75 d進行直腸觸診為標準，PAG ELISA試劑盒的準確性。

從表3可以得出，PAG ELISA試劑盒妊娠診斷的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準確性分別為100%、75.5%、86.5%、100%和90.5%，Kappa為79.1%。PAG ELSIA試劑盒和直腸觸診妊娠診斷結(jié)果符合率很高。

Kappa(K)值適用于計數(shù)資料的一致性評測，由表2數(shù)據(jù)計算得來。Kappa值范圍在+1與-1之間。若Kappa值>0.6，表示一致性相當可靠。

本研究結(jié)果表明：

兩種妊檢方法的一致率

Po=a+d/N=(167+80)/273=90.5%

機遇一致率

Pe=[(a+c)(a+b)/N+(b+d)(c+d)/N]/N

=[(167×193)/273+(106×80)/273]/273=54.6%

非機遇一致率=1-Pe=1-54.6%=45.4%

實際一致率=Po-Pe=90.5%-54.6%

=35.9%

從以上Kappa值可以看出，兩種妊娠鑒別方法結(jié)果的一致有多大程度由非機遇所帶來，也即真正一致的程度。本試驗中Kappa為79.1%，表明PAG ELSIA試劑盒和直腸觸診兩種妊娠診斷結(jié)果符合率很高，應(yīng)用PAG ELSIA試劑盒完全能夠用于奶牛早期妊娠診斷。

3 討 論

IDEXX牛懷孕檢測試劑盒是根據(jù)酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理設(shè)計的、用于檢測懷孕早期存在于牛血清或EDTA血漿中的懷孕相關(guān)蛋白(PAGs)，此類蛋白可以作為牛懷孕的標志。微孔板已經(jīng)包被有懷孕相關(guān)蛋白抗體，將待檢樣品進行稀釋并孵育后，捕獲到的懷孕相關(guān)蛋白(PAG)可以與特異性的PAG抗體(檢測溶液)和辣根過氧化物酶標記物(酶標抗體)結(jié)合。未被結(jié)合的酶標抗體則被洗掉，隨后在孔內(nèi)加入TMB底物溶液。孔內(nèi)溶液的顏色深淺與樣品中PAG的含量成比例。最終結(jié)果通過酶標儀讀取并利用Xchek軟件進行陰陽性判讀。在本研究中，PAG ELISA試劑盒檢測母牛妊娠診斷的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準確性分別為100%、75.5%、86.5%、100%和90.5%，與直腸檢查75 d結(jié)果相同，表明該方法可用于母牛的早期妊娠診斷。Silva等[4]評估PAG判斷妊娠狀況準確性試驗中得出，PAG檢測方法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準確性分別為96.8%～98.9%、91.7%～97.3%、89.7%～93.8%、97.5%～99.5%和93.9%～97.8%，本研究與Silva等[4]的研究一致，說明PAG ELISA試劑盒檢測的敏感性和陰性預(yù)測值均很高，便于準確發(fā)現(xiàn)空懷牛，及時對其進行處理，及早再次配種，縮短配種間隔，達到減少空懷天數(shù)的目的。

表2 PAG ELISA試劑盒檢測結(jié)果的敏感性①、特異性②、陽性預(yù)測值③、陰性預(yù)測值④和準確性⑤的2×2列聯(lián)表評估表(n=273)Table 2 Contingency table (2×2) for evaluation of sensitivity①, specificity positive②, positive predictive value③, negative predictive value④, and accuracy⑤ of PAG ELISA test (n=273)

注：① 直腸觸診為妊娠樣品中，PAG檢測結(jié)果為陽性的比例[a/(a+c)]×100 ② 直腸觸診為空懷的樣品中，PAG檢測結(jié)果為陰性的比例[d/(d+b)]×100 ③ PAG檢測為已孕的牛只，確定為真實妊娠[a/(a+b)]/×100 ④ PAG檢測為空懷的牛只，確定為真實為空懷[d/(c+d)]×100 ⑤ 妊娠狀況(妊娠+空懷)與直腸觸診結(jié)果一致的比例[(a+d)/N]×100

Note: ① Proportion of pregnant cows with a positive PAG outcome [a/(a+c)]×100 ② Proportion of nonpregnant cows with a negative PAG outcome [d/(d+b)]×100 ③ Proportion of cows diagnosed as pregnant by PAG that were truly pregnant [a/(a+b)]×100 ④ Proportion of cows diagnosed as nonpregnant based on PAG that were truly nonpregnant [d/(c+d)]×100 ⑤ Proportion of pregnancy status outcomes (pregnant and nonpregnant)that were correctly classified by PAG [(a+d)/N]×100

表3 人工授精后75 d直腸檢查結(jié)果評價28-45 d PAG ELISA試劑盒檢測的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準確性Table 3 Sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV), and accuracy of PAG 28-45 d after AI for determining pregnancy status75 d by rectal palpation

在本研究中，PAG ELISA試劑盒檢測的特異性和陽性預(yù)測值分別為75.5%和86.5%，兩種方法的差異性可能因為評估時間不統(tǒng)一。Silva等[4]的研究對試驗牛只采集血液進行PAG檢測后，立即應(yīng)用B超進行妊娠診斷，所以兩種診斷方法符合度很高。在本試驗中，PAG ELISA試劑盒在母牛配種后28 d診斷妊娠狀況，而該奶牛場直腸檢查法在母牛妊娠75 d時具有較高的準確性，因此選取了75 d直腸檢查的方法來評價PAG ELISA試劑盒檢測的準確性。在母牛早期妊娠診斷時，由于PAG ELISA試劑盒檢測法和直腸檢查法兩種孕檢方法無法同時進行(間隔47 d)，因而無法對其特異性(直腸檢查空懷樣品中，PAG ELISA試劑盒法檢測結(jié)果為陰性的比例)和陽性預(yù)測值(PAG ELISA試劑盒檢測為已孕的牛只，確定為真實妊娠)進行客觀評價，因為PAG ELISA試劑盒檢測至直腸檢查期間出現(xiàn)的胚胎死亡現(xiàn)象會干擾特異性和陽性預(yù)測值的評估[5]。另外，本試驗牛場牛奶尿素偏高，尿素氮升高，也會造成奶牛子宮中尿素氮的沉積過量，從而導(dǎo)致奶牛的胚胎死亡[6]。本次試驗結(jié)果未出現(xiàn)假陽性(PAG檢測陰性，直腸觸診為妊娠)，這對牧場繁殖管理至關(guān)重要，使用PAG ELISA試劑盒不會將已孕牛只診斷為空懷，而致使繁育人員錯誤的為已妊娠牛只進行發(fā)情處理，造成已妊娠奶牛的流產(chǎn)。

4 小 結(jié)

早期妊娠診斷是通過及早發(fā)現(xiàn)空懷牛，并對其進行再處理和再次輸精的方式，直接縮短產(chǎn)犢間隔。目前常用的直腸觸診法通常是在配種后60～90 d進行，與28 d使用牛妊娠相關(guān)糖蛋白診斷相比，對于一些發(fā)情表現(xiàn)不明顯或者無發(fā)情表現(xiàn)的空懷牛就失去了14 d甚至更多及早處理的時間。牛懷孕檢測試劑盒具有快速、準確、易于標準化等優(yōu)點，適用于規(guī)?；翀龅娜粘７敝彻ぷ?。

本試驗在小規(guī)模群體應(yīng)用后以評估PAG ELISA試劑盒法的準確性和該妊娠診斷方法的可操作性。如果對整個群體進行標準化應(yīng)用，將對牛場帶來不可低估的價值。牛懷孕檢測試劑盒為奶牛場提供了一種全新的母牛診斷工具，能在配種后更早時間進行妊娠診斷，無疑對盡早發(fā)現(xiàn)空懷牛和縮短胎間距有很大幫助，有利于牧場提高奶牛場繁殖狀況和經(jīng)濟效益，是規(guī)?；膛鲆环N理想的早期妊娠診斷方法。

參考文獻:

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[3] Noordhuizen J P T M,Frankena K,Thrusfield M V, et al. Measurement of disease frequency. Application of Quantitative Methods in Veterinary Epidemiology[M].2nd ed. Wageningen Pers:the Netherlands. 2001： 63-82.

[4] Silva E,Sterry R A,Kolb D, et al. Accuracy of a Pregnancy-Associated Glycoprotein ELISA to Determine Pregnancy Status of Lactating Dairy Cows Twenty-Seven Days After Timed Artificial Insemination[J]. J Dairy Sci,2007, 90:4 612-4 622.

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[6] 馬志憤.奶牛繁殖性能分析[J].新疆畜牧業(yè).2011, 8: 61-62.