Gas7在成年大鼠脊髓和脊神經(jīng)節(jié)的表達(dá)

侯良芹 熊克仁 丁艷霞 丁 見

（皖南醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，安徽蕪湖241000）

生長(zhǎng)休止基因家族（growth arresting specific，Gas）是一類細(xì)胞培養(yǎng)過程中由于血清饑餓或者細(xì)胞接觸性抑制時(shí)表達(dá)上調(diào)的基因，包括Gas1、Gas2、Gas3……Gas11等，這些基因編碼的蛋白質(zhì)缺少序列同源性，具有不同的功能［1－3］。Gas7是Gas基因家族中的一個(gè)亞型，主要表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小腦、大腦皮層和海馬，尤其高表達(dá)于小腦的浦肯野細(xì)胞［4］。資料顯示，Gas7還表達(dá)于胚胎干細(xì)胞和發(fā)育過程中的神經(jīng)系統(tǒng)，參與調(diào)控神經(jīng)元的分化、發(fā)育和凋亡［5－7］。但Gas7在成年大鼠脊髓和脊神經(jīng)節(jié)的表達(dá)和功能研究未見報(bào)道。本文采用RT－PCR方法、焦油紫染色以及免疫組織化學(xué)方法來檢測(cè)Gas7基因核酸和蛋白在成年SD大鼠脊髓和脊神經(jīng)節(jié)的表達(dá)，為進(jìn)行Gas7功能研究提供參考資料。

材料和方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

健康成年SD大鼠12只，清潔級(jí)，雌雄不拘，體重250±20g，購(gòu)自南京青龍山動(dòng)物中心，合格證號(hào)為SCXK（蘇）2009－0001。6只用于 RT－PCR實(shí)驗(yàn)，6只用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。

山羊抗Gas7抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的兔抗山羊二抗，DAB顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Trizol溶液購(gòu)自TaKa－Ra公司；Agarose－1000，Taq DNA Polymerase購(gòu)自Invitrogen，USA。大鼠Gas7和β－actin引物由上海捷銳生物工程公司合成。

2．RT－PCR方法檢測(cè)大鼠脊髓和脊神經(jīng)節(jié)Gas7mRNA的表達(dá)

大鼠直接斷頭處死，咬骨鉗打開椎管，取頸膨大部位的脊髓和與其相連的脊神經(jīng)節(jié)0．1g，同時(shí)取小腦組織作為陽(yáng)性對(duì)照。加入1ml Trizol溶液裂解。按Trizol試劑盒說明書提取總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)總RNA濃度，取1μg的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈待用，步驟按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行。接著，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Gas7和內(nèi)參β－actin的引物序列、PCR擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度及PCR反應(yīng)條件見表1。取PCR產(chǎn)物5μl，用濃度為1．2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

表1 引物序列及PCR反應(yīng)條件Table 1 Primers sequence and PCR condition

3．免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Gas7蛋白在大鼠脊髓和脊神經(jīng)節(jié)的表達(dá)

大鼠用劑量為50mg／kg的戊巴比妥鈉深度麻醉后，經(jīng)左心室先快速輸入150ml 0．9%生理鹽水，接著緩慢滴注含1%多聚甲醛和1．25%戊二醛的0．1mol／L磷酸緩沖液，結(jié)束后用咬骨鉗打開椎管，取出脊髓和脊神經(jīng)節(jié)，放入4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定12h，常規(guī)梯度酒精、二甲苯脫水、透明，石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚5μm，50℃烤片，時(shí)間長(zhǎng)短依據(jù)組織切片與玻片的貼合情況而定，備用。

組織切片脫蠟入水后，依次經(jīng)過微波抗原修復(fù)、3%H2O210min；5%BSA 37℃封閉30min后，滴加山羊抗Gas7抗體稀釋液（1∶100），4℃冰箱過夜；滴加HRP標(biāo)記的兔抗山羊二抗（1∶200），37℃孵育30min；DAB顯色，顯色時(shí)間長(zhǎng)短依據(jù)鏡下顯色情況而定，5min左右；梯度酒精脫水（從75%開始），二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍攝照片。本實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)染色成年大鼠小腦組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

4．焦油紫染色

為了更好地定位Gas7免疫陽(yáng)性反應(yīng)在脊髓的分布，我們將脊髓的切片同時(shí)進(jìn)行了焦油紫染色，來顯示脊髓神經(jīng)元的分布和形態(tài)。步驟如下：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，在焦油紫染色液（由0．1%的焦油紫加少量冰醋酸制備而成）中染色，37℃溫箱5－10min。梯度酒精分色（顯微鏡下觀察分色程度，使尼氏小體呈深紫色而背景基本無色）、脫水透明，中性樹膠封片。

結(jié) 果

1．Gas7mRNA在大鼠脊髓和脊神經(jīng)節(jié)的表達(dá)

PCR結(jié)果顯示，大鼠脊髓和脊神經(jīng)節(jié)有較豐富的Gas7mRNA表達(dá)。在凝膠電泳圖上（圖1），脊髓和脊神經(jīng)節(jié)Gas7的條帶很清晰，稍弱于作為陽(yáng)性對(duì)照的小腦組織的Gas7條帶。

圖1 RT－PCR結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖，顯示Gas7mRNA在成年大鼠脊髓和脊神經(jīng)節(jié)以及小腦的表達(dá)。泳道1，小腦；泳道2，脊髓和脊神經(jīng)節(jié)；泳道3，MarkerFig．1Electropherogram of Gas7mRNA expression in spinal cord and DRG，cerebellum of adult rat by RT－PCR on 1．2%agarose gel．Lane 1，cerebellum；Lane 2，spinal cord and DRG；Lane 3，Marker．

2．免疫組化方法顯示Gas7蛋白在大鼠脊髓和脊神經(jīng)節(jié)的表達(dá)和分布

Gas7蛋白免疫陽(yáng)性為棕黃色顆粒。作為陽(yáng)性對(duì)照的小腦組織切片上，浦肯野細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性著色（圖2H），與以往的報(bào)道一致［4］，而用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照的切片上無陽(yáng)性顯色，說明本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是特異性的、準(zhǔn)確可靠的。

在脊髓切片上，根據(jù)作為對(duì)照的焦油紫染色中神經(jīng)元的分布，Gas7免疫陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)、大小和位置（圖2A－C）如下：Gas7蛋白既表達(dá)于脊髓的灰質(zhì)，也表達(dá)于白質(zhì)。脊髓灰質(zhì)前角的聯(lián)絡(luò)神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元均有表達(dá)，主要位于神經(jīng)元的胞漿和胞膜，部分神經(jīng)元的突起也呈陽(yáng)性，細(xì)胞核不著色，尤其是Ⅸ版層大的α－運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和小的γ－運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，顯色較深。頸膨大部位灰質(zhì)前角Gas7陽(yáng)性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量較多（圖2D），胸髓灰質(zhì)前角數(shù)量較少（圖2E）。脊髓灰質(zhì)后角Ⅱ版層膠狀質(zhì)Gas7表達(dá)較強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞多為體積很小的卵圓形神經(jīng)元，分布較密集（圖2F）。后角Ⅲ－Ⅵ版層Gas7陽(yáng)性神經(jīng)元形體較大，數(shù)量較少，散在分布。脊髓白質(zhì)Gas7蛋白免疫陽(yáng)性顯色較弱且分布均勻（圖2E）。脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)大型感覺神經(jīng)元呈Gas7免疫強(qiáng)陽(yáng)性著色，中、小型感覺神經(jīng)元為弱陽(yáng)性著色，胞體為圓形或卵圓形（圖2G）。

圖2 脊髓組織切片（A頸膨大灰質(zhì)的前角，B胸髓灰質(zhì)的前角，C頸膨大灰質(zhì)后角膠狀質(zhì)）的焦油紫染色以及Gas7蛋白在脊髓（D頸膨大灰質(zhì)的前角，E胸髓灰質(zhì)的前角，F(xiàn)頸膨大灰質(zhì)后角膠狀質(zhì)）、脊神經(jīng)節(jié)（G）和小腦（H）表達(dá)的免疫組織化學(xué)圖片。圖A、B、D和E，長(zhǎng)箭頭表示大的α－運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，短箭頭表示小的γ－運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元；圖G，長(zhǎng)箭頭表示強(qiáng)陽(yáng)性顯色的大型感覺神經(jīng)元，短箭頭表示弱陽(yáng)性顯色的中、小型感覺神經(jīng)元。圖A－C是焦油紫染色；圖D－H是免疫組織化學(xué)染色。標(biāo)尺＝100μm。Fig．2Nissl staining of adult rat spinal cord tissue section（A，B and C）and the expression of Gas7protein in adult rat spinal cord（D，E and F），DRG （G）and cerebellum （H）by immunohistochemistry．In A，B，D and E，arrow indicatedα－motor neurons and arrow head indicatedγ－motor neurons．In G，arrow indicated large diameter sensory neurons which were strongly stained and arrow head indicated medium and small diameter sensory neurons which were faintly stained．A－C：Nissl staining；D－H：Immunohistochemistry staining．Scale bars＝100μm．

討 論

目前的資料顯示，Gas7基因主要表達(dá)于小腦、大腦皮層和海馬等處［4］，在神經(jīng)系統(tǒng)其它部位的表達(dá)和功能的資料很少。本文用RT－PCR和免疫組化等方法研究了Gas7mRNA和蛋白在成年大鼠脊髓和脊神經(jīng)節(jié)的表達(dá)和分布，發(fā)現(xiàn)脊髓和脊神經(jīng)節(jié)有較高的Gas7mRNA的表達(dá)；脊髓灰質(zhì)聯(lián)絡(luò)神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以及脊神經(jīng)節(jié)的感覺神經(jīng)元都表達(dá)Gas7蛋白，主要位于神經(jīng)元的胞漿、胞膜和突起，細(xì)胞核不表達(dá)。這些結(jié)果提示Gas7可能參與了脊神經(jīng)節(jié)和脊髓感覺的傳導(dǎo)和運(yùn)動(dòng)的控制。

脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)的假單極神經(jīng)元根據(jù)體積大小可分為大、中、小型3種，它們的周圍突到達(dá)軀體和內(nèi)臟的各種感受器，中樞突進(jìn)入脊髓。其中大型神經(jīng)元發(fā)出有髓鞘的粗纖維Aα和Aβ，進(jìn)入脊髓后，部分纖維不在后角交換神經(jīng)元，直接進(jìn)入同側(cè)脊髓后索，形成薄束和楔束傳導(dǎo)本體感覺；部分纖維終止于后角，傳導(dǎo)機(jī)械性感覺如觸覺等。而中、小型神經(jīng)元發(fā)出薄髓的Aδ和無髓的C纖維，主要終止于脊髓灰質(zhì)后角的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ層，傳導(dǎo)溫度覺和痛覺等淺感覺［8］。大量傳導(dǎo)痛覺和傷害性感覺的C纖維到達(dá)后角Ⅱ版層膠狀質(zhì)，膠狀質(zhì)由分布密集的小神經(jīng)元組成，主要參與痛覺和傷害性感覺的分析［9－10］。本實(shí)驗(yàn)中，Gas7蛋白高表達(dá)于脊神經(jīng)節(jié)的大型神經(jīng)元，提示其對(duì)深感覺和機(jī)械性感覺的傳導(dǎo)可能起著重要的作用。Gas7蛋白在脊神經(jīng)節(jié)中、小型神經(jīng)元的表達(dá)相對(duì)較弱，但在中、小型神經(jīng)元發(fā)出的C纖維的主要靶區(qū)－后角膠狀質(zhì)，密集分布的小神經(jīng)元高表達(dá)Gas7蛋白，說明其可能參與了痛覺的分析和調(diào)控。資料顯示，Gas7蛋白位于胞漿和細(xì)胞膜附近，其羧基端序列能與肌動(dòng)蛋白相互作用，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚合和肌動(dòng)蛋白絲的交聯(lián)，進(jìn)而促進(jìn)微絲微管的重組和形成，參與膜改變的動(dòng)力學(xué)過程，例如突起的形成和細(xì)胞的遷移等［11－13］。本文觀察到的Gas7蛋白表達(dá)于成年大鼠脊髓和和脊神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元，可能與神經(jīng)元突起的維護(hù)和修復(fù)有關(guān)，進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)元的功能，具體機(jī)制有待進(jìn)一步的功能研究來闡明。

最近，Huang BT等人［14］為了研究 Gas7的生理功能，他們用轉(zhuǎn)基因的方法制備了Gas7缺陷小鼠，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增大，Gas7缺陷小鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Gas7缺陷小鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量減少，骨骼肌快、慢肌纖維的構(gòu)成發(fā)生改變，肌張力降低；同時(shí)，在神經(jīng)肌接頭處，神經(jīng)纖維末端的出芽現(xiàn)象大大減少。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果給出了合理的形態(tài)學(xué)上的解釋，我們發(fā)現(xiàn)在脊髓灰質(zhì)的前角，尤其是頸膨大和腰骶膨大處，Ⅸ版層內(nèi)側(cè)核和外側(cè)核部位的軀體運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元高表達(dá)Gas7，包括大的α－運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和小的γ－運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。這些結(jié)果提示Gas7在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元支配骨骼肌的生理過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，結(jié)合Gas7膜的動(dòng)力學(xué)功能，可能參與了軸突末梢的生長(zhǎng)和修復(fù)以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等。

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