微管相關(guān)蛋白tau在不同年齡大鼠海馬內(nèi)的定位分布特點

李 青 周金和 紀(jì)浩洋 張艷玲 蔣詩韻傅 婷 汪薇曦 張敏海 李宏蓮 沈建英＊

（1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院第二臨床學(xué)院，武漢430030； 2武漢市第六醫(yī)院藥劑科，武漢430015； 3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，武漢430030）

微管系統(tǒng)是神經(jīng)細(xì)胞骨架成分，可參與多種細(xì)胞功能。微管由微管蛋白及微管相關(guān)蛋白組成，tau蛋白是含量最高的微管相關(guān)蛋白。tau蛋白通過與微管蛋白tubulin的相互作用，將tubulin組裝成微管［1］，并且與形成的微管結(jié)合，維持其穩(wěn)定性，降低微管蛋白分子的解離，并誘導(dǎo)微管成束，維持神經(jīng)元的細(xì)胞形態(tài)并參與軸漿運輸［2，3］。

tau蛋白為磷蛋白，其生物活性由其磷酸化程度來調(diào)控，過度磷酸化的tau蛋白與微管結(jié)合的能力降低從而破壞微管的穩(wěn)定性［2］。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有超過20種神經(jīng)退行性疾病與tau相關(guān)［4］，這些疾病中，大都存在tau蛋白異常磷酸化和聚集成為神經(jīng)纖維纏結(jié)［5］。阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是最常見的中樞神經(jīng)退行性疾病，患者腦中tau蛋白總量多于正常人，但正常tau蛋白減少而磷酸化的tau蛋白大量增加，過度磷酸化的tau自身聚集成雙螺旋 神 經(jīng) 原 纖 維 纏 結(jié) （Neurofibrillary tangles，NFTs），微管系統(tǒng)被破壞，正常軸漿轉(zhuǎn)運受損，突觸丟失，發(fā)生腦神經(jīng)元退行性病變［6］。因此，tau蛋白的含量和磷酸化水平與神經(jīng)細(xì)胞的生存命運和功能喪失之間必然存在著緊密的聯(lián)系。

海馬位于顳葉，是大腦邊緣系統(tǒng)的一部分，由齒狀回（顆粒細(xì)胞），CA1－CA4（錐體細(xì)胞）部位以及腦下腳組成，具有學(xué)習(xí)記憶及空間定位功能，是多種有癡呆癥狀的神經(jīng)退行性疾病重要的受累區(qū)域。

tau在神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制中的具體作用及其機(jī)制已經(jīng)有海量的文獻(xiàn)報道，但是有許多不一致的觀點，而tau在不同年齡正常大鼠腦內(nèi)的分布報道不多，尤其關(guān)于其在海馬內(nèi)的具體分布及發(fā)育特點鮮有報道。本實驗主要通過免疫組化ABC法，對大鼠正常腦組織海馬區(qū)中總tau和Ser396／404位點磷酸化的tau蛋白的分布及隨大鼠發(fā)育的變化趨勢進(jìn)行了初步的研究，并淺析了其與神經(jīng)細(xì)胞分裂增殖和分化間的關(guān)系。

材料和方法

1．抗體

一抗：兔來源多克隆抗體R134d1∶30000（識別總tau，由 Drs．Iqbals饋贈，New York State Institute for basic research，Staten Island，NY，USA）；單克隆PHF－1抗體1∶500（識別 Ser396／404位點磷酸化的tau，由Dr．P Davies饋贈，Albert Einstein College of Medicine，Bronx，NY，USA）。二抗：生物素化馬抗小鼠IgG抗體（1∶200）和生物素化羊抗兔IgG抗體（1∶200），ABC（鏈霉親和素－生物素－辣根過氧化物酶復(fù)合物，1∶200），DAB顯色試劑盒均購自飛奕科技公司。

2．實驗動物

SD大鼠來源于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。以雌雄比2∶1的比例合籠，次日以陰道涂片精子陽性為妊娠第1d，分別取孕18d，生后1d，1w，2w，2m 大鼠3－5只用于實驗。

3．免疫組織化學(xué)SABC法

孕18d、生后1d、1w大鼠全腦經(jīng)生理鹽水漂洗后置入4%多聚甲醛·0．1mol／L PB浸泡固定過夜，生后2w和2m大鼠經(jīng)常規(guī)心臟灌流固定（4%多聚甲醛·0．1mol／L PB），取腦后經(jīng)固定液后固定過夜，常規(guī)梯度酒精脫水、透明、浸蠟，包埋、石蠟切片機(jī)切片，片厚6μm。二甲苯脫蠟，梯度酒精下行到水，自來水 沖 洗，0．01mol／L PBS 漂 洗 后，0．3%Triton破膜，10%H2O2處理30min，3%BSA·PBS封閉30min。加入一抗PHF－1（1∶500）或者R134d（1∶30000），置于濕盒中4℃孵育48－72h，復(fù)溫2h，用0．01mol／L PBS漂洗10min×3次，加入二抗，生物素化羊抗兔IgG抗體（1∶200）或者生物素化馬抗小鼠IgG抗體（1∶200），置于濕盒中常溫孵育2h，用0．01mol／L PBS漂洗10min x 3次；滴加SABC復(fù)合物（1∶200），置于濕盒中常溫孵育2h，用0．01mol／L PBS漂洗10min×3次，DAB試劑盒顯色10－15min，自來水沖洗1－2min，0．01mol／L PBS漂洗10min×3次；蘇木素復(fù)染5s，立即用自來水沖洗5min，置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹脂封片。

結(jié) 果

1．大鼠大腦皮質(zhì)和海馬的發(fā)育演變過程

低倍鏡顯示從孕18d到出生后2m，大鼠大腦皮質(zhì)和海馬的發(fā)育演變過程及海馬的外形演變過程。孕18d大鼠大腦皮質(zhì)錐體細(xì)胞帶與海馬CA區(qū)的錐體細(xì)胞帶相連，大腦兩側(cè)半球相互靠攏，腦室尚未閉合，海馬的CA分區(qū)已經(jīng)基本形成；出生1d大鼠大腦兩側(cè)半球完全并攏，腦室閉合，大腦皮質(zhì)與海馬之間被胼胝體分隔。隨著腦的發(fā)育，大腦皮質(zhì)的錐體形神經(jīng)細(xì)胞由密集排列成細(xì)胞帶到逐漸分散，海馬CA區(qū)的神經(jīng)元數(shù)量逐漸減少，CA1區(qū)細(xì)胞帶變窄（圖1，2），這些結(jié)果說明，在胚胎期，大鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較多，隨著腦的發(fā)育，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。

2．總tau（R134d）陽性產(chǎn)物在不同年齡大鼠海馬內(nèi)的分布及變化趨勢

圖1 不同發(fā)育階段大鼠海馬內(nèi)R134d陽性產(chǎn)物的表達(dá)及分布。Fig．1Expression and distribution of R134dpositive substance in hippocampus of rats with different developmental stages

Fig1為孕18d、生后1d、1w、2w和2m大鼠腦冠狀切片，用免疫組織化學(xué)ABC法，以抗體R134d顯示總tau的表達(dá)和分布。左側(cè)低倍鏡顯示，R134d陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒狀，孕18d、生后1d和1w大鼠海馬內(nèi)有豐富的陽性物質(zhì)表達(dá)，而生后2w和2m其表達(dá)量明顯下降，甚至不易見。高倍鏡顯示前三個時間段，海馬內(nèi)陽性產(chǎn)物主要表達(dá)在海馬各區(qū)神經(jīng)細(xì)胞周圍，在胚胎期各區(qū)表達(dá)較均勻，在海馬始層和分子層均有表達(dá)，強(qiáng)度無明顯差異。生后1d和1w則顯示陽性產(chǎn)物主要分布在海馬CA1和CA2區(qū)始層，而這部分主要是錐體細(xì)胞軸突的分布區(qū)域，因此也證實了正常情況下tau主要分布于神經(jīng)元軸突內(nèi)，樹突甚至胞核內(nèi)也有少量分布；但是在生后1d的大鼠海馬CA3區(qū)，其分布于分子層的陽性產(chǎn)物多于始層，可能由于此區(qū)內(nèi)含有較多齒狀回（DG區(qū)）顆粒細(xì)胞的軸突。在生后2w和2m大鼠海馬內(nèi)各區(qū)均未見密集的陽性產(chǎn)物表達(dá)。此結(jié)果說明，胚胎期大鼠海馬內(nèi)tau蛋白高表達(dá)，而隨著腦的發(fā)育進(jìn)程，tau的表達(dá)逐漸下降，此變化與神經(jīng)元數(shù)量的下降相一致。

3．Ser396／404位點磷酸化tau（PHF－1）陽性產(chǎn)物在不同年齡大鼠海馬內(nèi)的分布及變化趨勢

圖2 不同發(fā)育階段大鼠海馬PHF－1陽性產(chǎn)物的表達(dá)及分布。Fig．2Expression and distribution of PHF－1positive substance in hippocampus of rats with different developmental stages

Ser396／404位點過度磷酸化在AD腦內(nèi)與神經(jīng)元纖維纏結(jié)（NFT）形成高度相關(guān)［7］，因此本課題重點顯示了tau蛋白的此位點磷酸化狀態(tài)。Fig2為孕18d、生后1d、1w、2w和2m大鼠腦冠狀切片，用免疫組織化學(xué) ABC法，使用抗體PHF－1顯示Ser396／404位點磷酸化tau的表達(dá)和分布，陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒狀。圖中低倍鏡顯示孕18d、生后1d和1w大鼠海馬內(nèi)有豐富的陽性產(chǎn)物表達(dá)，而生后2w和2m其表達(dá)量明顯下降，這些特征與總tau的分布相一致。高倍鏡顯示，孕18d大鼠海馬內(nèi)PHF－1陽性物質(zhì)在各區(qū)分布均勻，在始層和分子層分布也相似，生后1d的海馬內(nèi)，陽性產(chǎn)物出現(xiàn)分布變化，在CA1和CA2區(qū)，主要分布于始層，分子層表達(dá)極少，而在CA3區(qū)，主要分布于分子層；生后2w和2m大鼠海馬內(nèi)陽性產(chǎn)物表達(dá)很低，且在各區(qū)無明顯差異，這些分布特征也與總tau相似。

討 論

以上結(jié)果顯示，胚胎期到出生后至成熟期大鼠海馬CA區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量逐漸下降，同時伴隨著神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)tau總量的表達(dá)和PHF－1位點磷酸化tau的表達(dá)均下降。那么這兩者之前可能存在什么樣的關(guān)系呢？在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過程中是因為神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的減少從而導(dǎo)致tau表達(dá)和磷酸化tau表達(dá)的下降抑或是tau總量和PHF－1位點磷酸化tau蛋白的下降導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的下降？從圖片結(jié)果來看，伴隨胚胎發(fā)育，神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量下降非常明顯，而同時tau總量和PHF－1位點磷酸化tau的表達(dá)量極為顯著，到成熟期大鼠海馬內(nèi)幾乎難以檢測到明顯的tau和PHF－1位點磷酸化tau的表達(dá)，因此神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的下降不是tau和PHF－1tau下降的唯一原因，最有可能是兩者相互關(guān)聯(lián)，相互影響。

有研究表明，胚胎腦中tau蛋白的表達(dá)水平和磷酸化程度與AD腦中相似［8，9］，但從未有人在胚胎期觀察到NFTs的形成和神經(jīng)細(xì)胞的退行性變，因此可以推測，在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過程中高表達(dá)的tau和磷酸化的tau蛋白與AD腦中的作用不同，但tau蛋白在胚胎期神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)生變化的原因及是否對神經(jīng)細(xì)胞的分裂分化起作用目前未見報道。

大腦發(fā)育過程中，神經(jīng)上皮細(xì)胞通過有絲分裂大量增殖，隨后遷移，形成多層細(xì)胞，到達(dá)最終的定居區(qū)并分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，此時的神經(jīng)元并未成熟，但不再分裂，經(jīng)歷樹突軸突的生長，建立神經(jīng)元間突觸連接后才發(fā)育為成熟的神經(jīng)元［10，11］。胚胎時期，大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞大量分裂增殖，我們在此時期觀察到海馬神經(jīng)細(xì)胞中有大量的總tau蛋白和大量磷酸化的tau蛋白，因此我們推測，大量tau蛋白的表達(dá)和磷酸化可能與神經(jīng)細(xì)胞的分裂增殖存在某種關(guān)聯(lián)。

細(xì)胞周期是指一個細(xì)胞經(jīng)生長、分裂而增殖成兩個細(xì)胞所經(jīng)歷的全過程，包括DNA合成前期（G1期），DNA合成期（S期），DNA合成后期（G2期）和分裂期（M期）。在G1期起主要作用的是周期蛋白cyclinD，調(diào)節(jié)G1／S的過渡，它存在于核內(nèi)，細(xì)胞通過G1期進(jìn)入S期，cyclinD通過泛素化途徑降解［12，13］。有研究報道，糖原合酶激酶－3β（Glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）可通過磷酸化cyclinD的Thr－286位點調(diào)控其在細(xì)胞內(nèi)的定位，磷酸化的cyclinD從胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞漿中，使核內(nèi)cyclinD的表達(dá)水平下降［14］。已有報道GSK3β在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中表達(dá)水平極高［15］，由此我們考慮，為什么胚胎時期大量GSK－3β的存在并沒有因降低神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)cyclinD的水平而抑制神經(jīng)細(xì)胞分裂？tau蛋白是GSK3β的底物之一［16］，在神經(jīng)細(xì)胞的核內(nèi)和胞漿內(nèi)均有表達(dá)，胚胎期GSK3β以極高水平表達(dá)，同時又有高水平的tau，是否高表達(dá)的tau可以結(jié)合更多的GSK3β，從而阻止cyclinD被磷酸化，維持G1期核內(nèi)cyclinD的量，使細(xì)胞處于活躍的分裂狀態(tài)？

出生后的幼年大鼠海馬神經(jīng)元不再分裂，經(jīng)歷樹突軸突的生長，建立神經(jīng)元間突觸連接后發(fā)育為成熟的神經(jīng)元［10，11］。神經(jīng)元分化過程中，經(jīng)歷軸、樹突的生長，此時神經(jīng)元突起末端的生長錐感受細(xì)胞外生長和導(dǎo)向信息，通過微管和微絲運動使細(xì)胞形成樹突和軸突，并不斷生長、延伸或坍塌。細(xì)胞骨架系統(tǒng)不斷進(jìn)行重排是細(xì)胞突起生長、確定方向和遷移的關(guān)鍵［17］。tau蛋白和微管相關(guān)蛋白1B（MAP1B）都參與微管的這種動態(tài)的裝配和解聚，同時都是GSK3β的底物［18，19］。我們在前期實驗中觀察到，胚胎期大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)有大量tau蛋白，且重要的PHF－1位點磷酸化水平也很高，出生后則顯著下降，由此我們考慮，當(dāng)tau蛋白高度磷酸化時，與微管結(jié)合力下降，微管穩(wěn)定性降低，神經(jīng)元突起的生長被抑制［19］；而隨著大鼠腦的發(fā)育，tau蛋白的含量及磷酸化的tau蛋白含量逐漸下降，此期間總tau蛋白和磷酸化tau蛋白含量下降是否減少與MAP1B競爭GSK3β，使更多的MAP1B被磷酸化，促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長？

總tau和磷酸化tau在胚胎期和出生后早期的分布及變化規(guī)律之間究竟存在著什么聯(lián)系？是tau的變化調(diào)節(jié)了細(xì)胞的分裂和分化亦或是細(xì)胞的分裂和分化引起了tau的表達(dá)和磷酸化修飾的改變甚至這兩者間僅僅是相伴隨的現(xiàn)象？在本文中我們僅對此做了一些分析和推斷，明確其中的關(guān)系和調(diào)節(jié)機(jī)制還需要進(jìn)一步深入的研究。

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