β－catenin和WISP－1在糖尿病大鼠心肌中的表達(dá)

汪華學(xué) 陶 靜 葉紅偉 馮振中 高 琴＊

（1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院重癥監(jiān)護中心，安徽233004；2蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，3病理學(xué)教研室，安徽233030）

糖尿病是嚴(yán)重危害人類生活質(zhì)量的重大疾病之一。隨著人們生活水平的提高，人口老齡化以及肥胖發(fā)生率的增加，糖尿病的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。糖尿病患者心血管疾病的發(fā)生率較高，在有與糖尿病相關(guān)的死亡中，80%左右與心血管疾病有關(guān)。糖尿病引起的心血管疾病發(fā)病機制非常復(fù)雜，涉及代謝紊亂、胰島素抵抗、心肌細(xì)胞增生、肥大、心肌間質(zhì)膠原沉積及纖維化、細(xì)胞凋亡等多種機制。

Wnt信號途徑是由Wnt蛋白及其受體、調(diào)節(jié)蛋白等組成的復(fù)雜的信號通路，參與胚胎的生長和形態(tài)發(fā)育、能量代謝的平衡、干細(xì)胞的維持等多種生物學(xué)過程的調(diào)控，其中對 Wnt／β－catenin通路的研究最為深入。β－catenin是經(jīng)典 Wnt通路中關(guān)鍵的胞內(nèi)效應(yīng)分子，它進入細(xì)胞核后通過與LEF／TCF家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控特定基因的表達(dá)［1］。Wnt信號通路除了參與正常的生理過程外，還參與腫瘤的形成、創(chuàng)傷修復(fù)、糖尿病的發(fā)生、心肌梗死等病理變化［2－3］。

Wnt誘 導(dǎo) 分 泌 蛋 白－1（Wnt－induced secreted protein－1，WISP－1）是 Wnt信號通路活化后的下游靶基因之一［4］。最近研究表明，WISP－1參與器官損傷修復(fù)，肺、心、肝等臟器纖維化的發(fā)生。糖尿病誘導(dǎo)的心肌損傷是否與 Wnt／β－catenin信號通路及下游WISP－1有關(guān)，報道較少。實驗通過觀察 Wnt／β－catenin信 號 通 路 中 β－catenin 和 下 游 靶 基 因WISP－1在糖尿病心肌中的表達(dá)，分析該途徑在糖尿病心肌損傷中的作用。

材料和方法

1．材料

1．1藥品和試劑

鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，美國Sigma公司），血糖測定儀（臺欣生物科技研發(fā)股份有限公司），羥脯氨酸（hydroxyproline，Hp）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。β－catenin和 WISP－1抗體購置美國Santa Cruz公司。

1．2實驗動物

健康雄性Sprague－Dawley大鼠，體重（200±20）g，清潔級，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

2．方法

2．1實驗分組和動物模型制備

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后隨機分為正常對照組（Control Group）和糖尿病組（DM Group）。DM 組大鼠空腹12h后腹腔注射STZ 55mg／kg（0．1mol·L－1，pH＝4．4的枸櫞酸鹽緩沖液在冰浴下配制成11mg·ml－1的 STZ 溶液），72h后測空腹血糖≥16．7mmol／L為造模成功。大鼠充足飼料，自由飲水。實驗持續(xù)8w。

2．2空腹血糖監(jiān)測

各組大鼠喂養(yǎng)至8w，尾靜脈取血測定空腹血糖水平。

2．3心體比測定

至8w末稱取大鼠體重。大鼠處死后，稱取心臟重量，計算心臟重量與大鼠體重之比，即心體比。

2．4心肌組織羥脯氨酸含量測定

至8w末，動物處死后取左室心肌組織約100mg于－80℃冰箱保存，按照試劑盒說明書依次操作測定Hp含量。

2．5電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)變化

取心肌組織切成1mm3組織塊，立刻置于3%戊二醛。10g／l鋨酸固定，梯度乙醇脫水包埋后，超薄切片，電子染色，日產(chǎn)JEM－1230型透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)改變。

2．6免疫組化測定心肌β－catenin和 WISP－1蛋白表達(dá)

甲醛固定心尖部心肌組織，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片。免疫組織化學(xué)染色（SP法）觀察心肌組織βcatenin和WISP－1蛋白表達(dá)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。顯微鏡下判斷胞漿內(nèi)無棕黃色反應(yīng)物或僅有極少棕黃色顆粒為陰性（－）；細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)淺棕色為弱陽性（＋）；中等棕黃色為中等陽性（＋＋）；深棕黃色為較強陽性（＋＋＋）；棕褐為強陽性（＋＋＋＋）［5］。采用 HPLAS－2000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)對蛋白進行分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野，測定每個視野陽性面積和所有細(xì)胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野陽性面積率的平均值作為該例的測量值（陽性面積率＝單位面積中陽性反應(yīng)總面積／單位面積中細(xì)胞總面積×100%）。

3．統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，兩兩比較采用t檢驗。

結(jié) 果

1．大鼠空腹血糖和心體比

與正常對照組相比，糖尿病組大鼠空腹血糖水平明顯上升，心體比增加（表1），提示糖尿病引起心肌肥大。

2．大鼠心肌羥脯氨酸含量

與正常對照組相比，糖尿病組大鼠心肌羥脯氨酸含量明顯增加（表1），提示糖尿病可誘導(dǎo)心肌纖維化的發(fā)生。

3．心肌超微結(jié)構(gòu)改變

電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)變化，對照組大鼠心肌細(xì)胞肌原纖維排列整齊、規(guī)則，線粒體膜完整，無腫脹。糖尿病組心肌肌原纖維排列模糊，可見肌小節(jié)斷裂；線粒體腫脹、部分膜破損，有空泡形成（圖1）。

表1 血漿空腹血糖水平、心體比和心肌羥脯氨酸含量化（±s）Table 1 Plasma fasting blood glucose（FBG）level，heart weight／body weight（H／W）and cardiac hydroxyproline（Hp）content（±s，n＝8）

表1 血漿空腹血糖水平、心體比和心肌羥脯氨酸含量化（±s）Table 1 Plasma fasting blood glucose（FBG）level，heart weight／body weight（H／W）and cardiac hydroxyproline（Hp）content（±s，n＝8）

＊＊P＜0．01compared with Control group

Group FBG（mmol／L） H／W （mg／g） Hp（umol／mg）Control Group 8．49±2．13 3．47±0．07 0．28±0．06 DM Group 32．48±3．20＊＊ 4．48±0．11＊＊ 0．43±0．04＊＊

4．大鼠心肌β－catenin和 WISP－1蛋白表達(dá)

免疫組化蛋白表達(dá)結(jié)果顯示正常對照組心肌細(xì)胞胞漿和細(xì)胞連接處可見少量散在分布的棕黃色顆粒，β－catenin蛋白表達(dá)成（＋）；DM組心肌細(xì)胞胞漿和細(xì)胞連接處可見廣泛密集呈彌散分布的棕黃色顆粒，陽性表達(dá)增強，達(dá)（＋＋＋）（圖2，表2）；DM 組心肌β－catenin蛋白表達(dá)陽性面積率明顯高于正常對照組（P＜0．01）。WISP－1陽性表達(dá)定位于胞漿，正常對照組心肌細(xì)胞胞漿極少棕黃色顆粒，蛋白表達(dá)呈（－）；DM組心肌細(xì)胞胞漿可見廣泛密集呈彌散分布的棕黃色顆粒，表達(dá)呈（＋＋＋）（圖3，表2）；DM組心肌WISP－1蛋白表達(dá)陽性面積率明顯高于正常對照組（P＜0．01）。

圖1 正常大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)1A）和糖尿病大鼠（1B）心肌超微結(jié)構(gòu)（×10K）。圖2 β－catenin在正常大鼠心肌（2A）和糖尿病大鼠心?。?B）中的表達(dá)（SP×400）。圖3 WISP－1在正常大鼠心?。?A）和糖尿病大鼠心肌（2B）中的表達(dá)（SP×400）。Fig．1Myocardium ultrastructure in control rat（1A）and diabetic rat（1B）（×10K）Fig．2Expression of myocardialβ－catenin in control rat（2A）and diabetic rat（2B）（SP×400）Fig．3Expression of myocardial WISP－1in control rat（3A）and diabetic rat（3B）（SP×400）

表2 β－catenin和 WISP－1在大鼠心肌組織的表達(dá)（ˉx±s，n＝8）Table 2 Expressions ofβ－catenin and WISP－1 proteins in myocardium tissues（ˉx±s，n＝8）

討 論

實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，糖尿病大鼠空腹血糖明顯增高，心體比增加，心肌羥脯氨酸含量增加，心肌超微結(jié)構(gòu)顯示肌纖維斷裂，線粒體損傷，心肌β－catenin和 WISP－1表達(dá)增加，提示 Wnt／βcatenin信號通路在糖尿病誘導(dǎo)的心肌損傷中被激活，可能與糖尿病誘導(dǎo)的心肌肥大、心肌纖維化的發(fā)生有關(guān)。

β－catenin是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游元件。Wnt信號途徑是否激活取決于細(xì)胞內(nèi)游離β－catenin的水平［6］。正常情況下胞質(zhì)內(nèi)β－catenin受多種蛋白質(zhì)的共同調(diào)控，胞質(zhì)內(nèi)游離β－catenin水平極低。當(dāng)Wnt因子與其受體結(jié)合，Wnt信號傳導(dǎo)使GSK3－β被抑制，β－catenin不能被正常水解而積累，過量的β－catenin進入細(xì)胞核與目的基因結(jié)合，促進細(xì)胞增殖。因此β－catenin水平的增高提示 Wnt信號通路的激活。Wnt／β－catenin信號通路在心肌損傷中的作用越來越引起重視。Hahn等研究表明，βcatenin過表達(dá)可刺激新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞的增殖、分化，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大［7］。小鼠心肌梗死模型中，Wnt信號通路被激活［8］。急性心肌梗死時，損傷部位的心外膜和心肌成纖維細(xì)胞Wnt通路被激活［9］。以上結(jié)果顯示 Wnt信號通路參與心肌損傷。糖尿病誘導(dǎo)心肌肥大、心肌纖維化的發(fā)生，Wnt信號通路是否參與糖尿病引起的心肌病變呢？實驗中我們觀察到糖尿病大鼠喂養(yǎng)至8w，隨著心肌肥大和纖維化的發(fā)生（心體比的增高和心肌羥脯氨酸含量的增加），心肌β－catenin表達(dá)增高，提示 Wnt信號通路亦參與糖尿病誘導(dǎo)的心肌損傷。

WISP－1是一種富含半胱氨酸的分泌性蛋白多肽，可由成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞合成分泌，存在于多種組織器官。WISP－1作為β－catenin的下游靶基因之一，可促進細(xì)胞增殖、介導(dǎo)細(xì)胞黏附、促進細(xì)胞外基質(zhì)合成、刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)移等，同時也調(diào)節(jié)較復(fù)雜的生物學(xué)過程，參與血管形成和腫瘤發(fā)生。WISP－1被認(rèn)為是促進纖維化發(fā)生的主要細(xì)胞因子。Colston等報道WISP－1可促進原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞增殖，同時促進心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成［10］。心肌梗死后過度表達(dá)WISP－1及其受體黏合素，WISP－1可能通過黏合素分子信號通路觸發(fā)下游反應(yīng)，引起 WISP－1信號增強，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、成纖維細(xì)胞增生和心肌纖維化的發(fā)生。糖尿病心肌損傷與WISP－1的關(guān)系尚未見報道。本實驗中我們觀察到，隨著糖尿病大鼠心肌β－catenin表達(dá)增高，WISP－1表達(dá)亦增加，我們推測糖尿病病程發(fā)展過程中，高糖通過激活Wnt／β－catenin信號通路引起下游 WISP－1表達(dá)增多，誘導(dǎo)糖尿病大鼠心肌肥大和心肌纖維化的發(fā)生，其具體機制還有待進一步研究。

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