過氧化氫干霧對生物安全柜微環(huán)境表面消毒效果的研究

孫志平，韓文東，丁悅娜，瞿滌,2

1. 上海復旦大學三級生物安全防護實驗室，上海 200032； 2. 復旦大學上海醫(yī)學院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學分子病毒學重點實驗室，上海 200032

生物安全實驗室微環(huán)境消毒是控制實驗室污染的重要環(huán)節(jié)，而生物安全柜是生物安全實驗室中的關鍵設備，對感染性病原微生物的操作均應盡量在生物安全柜內(nèi)進行。因此，生物安全柜存在被污染的風險，特別是在操作抵抗力強的病原微生物(如結(jié)核分枝桿菌等)時風險更大。當實驗結(jié)束后或污染事故(如意外潑灑)發(fā)生時，必須進行生物安全柜內(nèi)表面和空間的微環(huán)境消毒。生物安全柜的常規(guī)消毒方式主要采用消毒劑擦拭，但該方法無法徹底清除潛在的污染，因此需采用更加有效的空間消毒方式，如消毒劑蒸汽或氣溶膠熏蒸[1]。過氧化氫干霧消毒方法廣泛應用于病原微生物實驗室微環(huán)境消毒，但其對不同病原微生物的消毒效果有待研究。

目前，實驗室微環(huán)境的消毒方式可分為化學消毒法和物理消毒法，其中化學消毒法主要采用甲醛、環(huán)氧乙烷、二氧化氯、過氧乙酸等熏蒸或霧化，對病原微生物具有良好的殺菌作用。然而，這些消毒劑在使用中存在一些缺陷：或具有毒性/致癌性，或?qū)Νh(huán)境不友好，或?qū)x器具有一定的腐蝕性，或易燃、易爆等[2]。過氧化氫是一種強氧化劑，適用于傷口消毒及環(huán)境、食品消毒[3]。過氧化氫因毒性小且對環(huán)境友好，其在空間消毒中的應用越來越受關注[4-7]。通過干性或濕性霧化后，過氧化氫氣溶膠具有更強的氧化性，能均勻彌散至空間的各個角落，其中干性霧化的彌散效果較好，可用于病原微生物實驗室或潔凈室空間的消毒[6,8-11]。因不同病原微生物對消毒劑及消毒方式的抵抗力存在差異，本文研究了過氧化氫干霧法對生物安全柜的空間及微環(huán)境表面常見病原微生物的消毒效果，提出適用于生物安全柜微環(huán)境表面干霧消毒的程序和措施。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種嗜熱脂肪芽胞桿菌菌片(SS1.K31)、枯草芽胞桿菌黑色變種(ATCC 9372)購自北京鑫四環(huán)消毒技術開發(fā)有限公司，恥垢分枝桿菌(MC2155)由第四軍醫(yī)大學徐志凱教授惠贈，金黃色葡萄球菌(ATCC 49230)、表皮葡萄球菌(ATCC 1457)和大腸埃希菌(DH5a)由本實驗室課題組保存。

1.1.2試劑胰蛋白胨、酵母提取物、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptone soya broth, TSB)購自英國Oxiod公司，溴甲酚紫(染料含量為90%)、無水D-葡萄糖(純度≥99.5%)購自Sigma公司，Difco Middlebrook 7H9肉湯培養(yǎng)基、Difco Middlebrook 7H10 瓊脂培養(yǎng)基、BBL Middlebrook ADC Enrichment培養(yǎng)基和BBL Middlebrook OADC Enrichment培養(yǎng)基購自美國BD公司，過氧化氫溶液(濃度6%)為法國Devea公司產(chǎn)品(O2SAFE)。

1.1.3過氧化氫干霧發(fā)生器過氧化氫干霧發(fā)生器(法國Devea公司，型號：PHILEAS 20D)通過高速離心方式每分鐘發(fā)散6 ml過氧化氫，產(chǎn)生粒徑<10 μ m的過氧化氫氣溶膠(干霧)。

1.2 方法

1.2.1細菌菌片的制備金黃色葡萄球菌(ATCC 49230)、表皮葡萄球菌(ATCC 1457)培養(yǎng)于TSB培養(yǎng)基，大腸埃希菌(DH5a)培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基，恥垢分枝桿菌(MC2155)培養(yǎng)于Middlebrook 7H9培養(yǎng)基， 37 ℃振蕩培養(yǎng)。金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大腸埃希菌培養(yǎng)12 h，恥垢分枝桿菌培養(yǎng)48 h，分光光度計測定600 nm處光密度(optical density，OD)，菌液稀釋至OD600=1作為測試原液。金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大腸埃希菌OD600=1時濃度約為1×109CFU/ml，恥垢分枝桿菌濃度約為1×108CFU/ml。分別將細菌測試原液稀釋10、100、1 000倍，吸取100 μ l稀釋菌液并涂布于0.5 cm×2.0 cm濾紙(Bio-Rad)。金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大腸埃希菌菌片的含菌量分別為1×108、1×107、1×106、1×105CFU；恥垢分枝桿菌菌片的含菌量分別為1×107、1×106、1×105、1×104CFU。嗜熱脂肪芽胞桿菌菌片(SS1.K31)、枯草芽胞桿菌黑色變種(ATCC 9372)菌片的含菌量約為1×106CFU。

1.2.2過氧化氫干霧發(fā)生器消毒方案將4個稀釋度菌片放置于12孔板中，每個稀釋度3片，共2塊(A、B)板，分別放置于生物安全柜內(nèi)操作臺面左右兩端(圖1)。各濃度的菌片均設置陰性和陽性對照。以不進行處理的菌片為陰性對照，壓力蒸汽滅菌(121 ℃，20 min)處理的菌片為陽性對照。過氧化氫干霧發(fā)生器消毒效果檢測分為3個階段。①消毒前準備：在生物安全柜內(nèi)相應位置放置過氧化氫干霧發(fā)生器和細菌菌片(圖1)，并用薄膜紙封閉生物安全柜的前窗口。②消毒過程：發(fā)生器產(chǎn)生過氧化氫干霧的程序可分為連續(xù)發(fā)生和間斷重復發(fā)生2種形式，在干霧發(fā)生過程中每分鐘可將6 ml過氧化氫溶液轉(zhuǎn)化為干霧。一般情況下，短時、多次發(fā)生有利于干霧的分散。干霧發(fā)生結(jié)束后靜置120 min。為摸索過氧化氫干霧殺滅細菌的效果，針對生物安全柜(0.8 m3)設計了4個不同的消毒程序(表1)。③消毒結(jié)束后檢測：開啟生物安全柜的通風，待過氧化氫干霧排凈后，重新蓋上12孔板，在生物安全柜內(nèi)取出菌片進行培養(yǎng)。

表1過氧化氫干霧發(fā)生器消毒程序的設置

Tab.1 The procedures of H2O2dry-mist sterilization

ProcedureGeneration (min)Interval (min)CycleSterilization (min)Total volume of H2O2 (ml)Volume of H2O2 (ppm)12101120121522105120607532101012012015041581204860

A and B location: the right/left site of the biosafety cabinet (BSC) surface for laying indicator bacteria (B.subtilis,B.stearothermophilus,E.coli,S.aureus,S.epidermidisandM.smegmatis). The middle site of BSC surface for laying H2O2delivery device generating dry-mist.

圖1生物安全柜內(nèi)過氧化氫干霧發(fā)生器和菌片的位置

Fig.1 The location of H2O2disinfector and indicators on the BSC surface

1.2.3過氧化氫消毒效果的微生物檢測過氧化氫干霧發(fā)生器消毒程序結(jié)束后取出菌片，置于5 ml相應液體培養(yǎng)基中。其中嗜熱脂肪芽胞桿菌菌片培養(yǎng)前需90 ℃孵育60 min。嗜熱脂肪芽胞桿菌的培養(yǎng)基為溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(含1%胰蛋白胨、0.5%葡萄糖和0.1%溴甲酚紫乙醇溶液指示劑)，56 ℃振蕩培養(yǎng)；枯草芽胞桿菌黑色變種和大腸埃希菌的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(含0.5%酵母提取物、1%胰蛋白胨和0.5%氯化鈉)；恥垢分枝桿菌的培養(yǎng)基為Middlebrook 7H9培養(yǎng)基(含10% OADC)；金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的培養(yǎng)基為TSB培養(yǎng)基(含0.5%大豆蛋白胨、1.5%胰蛋白胨和0.5%氯化鈉)。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、恥垢分枝桿菌和枯草芽胞桿菌在37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液澄清，無可見細菌菌落，則判定為無細菌生長。嗜熱脂肪芽胞桿菌在56 ℃振蕩培養(yǎng)168 h后，培養(yǎng)液為紫色澄清且未變?yōu)辄S色，無可見細菌菌落，則判定為無細菌生長。

2 結(jié)果

2.1 過氧化氫干霧采用不同消毒程序的殺菌效果

為了確定有效的過氧化氫干霧消毒程序，在減少過氧化氫對實驗儀器損害的前提下，設定了4個不同的過氧化氫干霧消毒程序，發(fā)散循環(huán)次數(shù)為1、5、10、8次，過氧化氫發(fā)散體積分別為15、75、150、60 ppm，靜置消毒時間均為120 min(表1)，利用枯草芽胞桿菌黑色變種菌片和嗜熱脂肪芽胞桿菌菌片作為指示菌進行研究。經(jīng)不同程序消毒后，分別取出菌片，根據(jù)指示菌的相應生長特性進行培養(yǎng)，其中枯草芽胞桿菌37 ℃培養(yǎng)24 h，嗜熱脂肪芽胞桿菌56 ℃培養(yǎng)168 h，觀察細菌培養(yǎng)液的變化情況?？莶菅堪麠U菌菌片經(jīng)4個程序消毒后，培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液均為透明澄清，未見細菌生長，與經(jīng)壓力蒸汽滅菌的菌片培養(yǎng)結(jié)果相同；而未經(jīng)消毒處理的菌片培養(yǎng)液(24 h)渾濁，可見細菌生長。然而，嗜熱脂肪芽胞桿菌菌片經(jīng)過程序1和2消毒后，培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液均由紫色澄清變?yōu)辄S色渾濁，與未經(jīng)消毒處理的菌片培養(yǎng)結(jié)果相似；而經(jīng)程序3和4消毒后，嗜熱脂肪芽胞桿菌菌片培養(yǎng)168 h，培養(yǎng)液保持紫色澄清，未見細菌生長(表2、3，圖2、3)。比較消毒程序3與4發(fā)現(xiàn)，消毒程序4 降低了過氧化氫干霧濃度，減少了對實驗儀器的損害，優(yōu)于消毒程序3。

表2過氧化氫干霧采用不同消毒程序的殺菌效果

Tab.2 Effect of H2O2dry-mist on killing bacterial spores with different procedures in the biosafety cabinet

Bacterium Negative controlProcedure 1Procedure 2Procedure 3Positive control?B. subtilis1×106 CFU+————B. stearothermophilus1×106 CFU+++——

Negative control, the filter paper containing bacterial spores (1×106CFU) without disinfection; Positive control, the filter paper containing bacterial spores sterilized by autoclave (121 ℃, 15 min). The filter papers containing bacterial spores were cultured in the medium for 24 h (B.subtilis, 37 ℃) and 1 week (B.stearothermophilus, 56 ℃). Observe turbidity of the culture. The turbid cultures (+) indicated bacteria growing on the papers. Oppositely, the limpid cultures (-) indicated papers being sterilized. The filter papers containing bacterial spores was disinfected with H2O2dry-mist for procedures 1, 2 and 3. Procedure 1: Generate H2O2dry-mist for 2 min, then sterilize for 2 h. Procedure 2: Generate H2O2dry-mist for 2 min for 5 cycles and suspend for 10 min, and then sterilize for 2 h. Procedure 3: Generate H2O2dry-mist for 2 min for 10 cycles and suspend for 10 min, and then sterilize for 2 h.

表3過氧化氫干霧采用消毒程序4對生物安全柜表面的殺菌效果

Tab.3 Effect of H2O2dry-mist on killing bacterial spores with procedure 4 in the biosafety cabinet

BacteriumNegative controlA locationB locationPositive controlB. subtilis1×106 CFU+———B. stearothermophilus1×106 CFU+———

Negative control, the filter paper containing bacterial spores (1×106CFU) without disinfection; Positive control, the filter paper containing bacterial spores sterilized by autoclave (121 ℃,15 min). A and B locations: the right/left site of the BSC surface for laying indicator bacteria (B.subtilisandB.stearothermophilus). Each bacterial strain had 3 repeats on the plates (12 wells) laying on A and B locations. The filter papers containing bacterial spores were disinfected by H2O2dry-mist with procedure 4 (generate H2O2dry-mist for 1 min for 8 cycles and suspend for 5 min, and then sterilize for 2 h). The filter papers containing bacterial spores were cultured in the medium for 24 h (B.subtilis, 37 ℃) and 1 week (B.stearothermophilus, 56 ℃). Observe turbidity of the culture. The turbid cultures (+) indicated bacteria growing on the papers. Oppositely, the limpid cultures (-) indicated papers being sterilized.

2.2 過氧化氫干霧采用消毒程序4對不同細菌的殺滅效果

采用消毒程序4(發(fā)散8次，總體積60 ml/m3空間)研究過氧化氫干霧對常見病原微生物大腸埃希菌(DH5a)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、表皮葡萄球菌(ATCC 1457)及恥垢分枝桿菌(MC2155，作為結(jié)核分枝桿菌模擬菌)等的消毒效果。首先制備上述細菌不同稀釋度的菌片，其中大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌片含菌量為1×105、1×106、1×107和1×108CFU，恥垢分枝桿菌菌片含菌量為1×104、1×105、1×106和1×107CFU，在各稀釋度均設置未消毒處理菌片和壓力蒸汽滅菌處理菌片分別作為陰性和陽性對照。將各稀釋度的菌片(每個稀釋度3片)放置于12孔板，分別安放于生物安全柜內(nèi)操作臺面左右兩側(cè)(圖1)，采用過氧化氫干霧消毒程序4進行消毒，取出菌片培養(yǎng)。結(jié)果顯示，經(jīng)過氧化氫干霧消毒后，大腸埃希菌1×108CFU菌片仍未見細菌生長；金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的1×105和1×106CFU菌片培養(yǎng)液均未見細菌生長，而1×107和1×108CFU菌片培養(yǎng)液均變渾濁；恥垢分枝桿菌1×107CFU菌片培養(yǎng)液渾濁，細菌生長，其余稀釋度的菌片培養(yǎng)液均澄清，未見細菌生長(表4、圖4)。

3 討論

生物安全實驗室中病原微生物污染最集中的部位是生物安全柜內(nèi)微環(huán)境，包括生物安全柜表面及空氣。國家新標準《實驗室生物安全通用要求》(GB 19489-2008)要求生物安全實驗室在關鍵部位配備局部消毒裝置。研究安全、有效的實驗室微環(huán)境中微生物消毒方法， 將為實驗室生物安全風險評估提供依據(jù)， 從而確保生物安全柜微環(huán)境中微生物污染的清除，降低實驗室感染事件發(fā)生的概率，同時也減少消毒劑對實驗人員的危害[12]。根據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)消毒技術規(guī)范》，實驗室空間消毒方式(紫外線照射、消毒劑熏蒸和噴霧等)主要歸類為化學消毒劑和物理作用方式。其中，紫外線的消毒作用較弱，消毒效果難以保證，因此實驗室微環(huán)境表面消毒通常采用化學消毒劑進行消毒[13]?；瘜W消毒劑主要包括甲醛、環(huán)氧乙烷、二氧化氯、過氧乙酸和過氧化氫等。其中，甲醛熏蒸的消毒效果已得到驗證，被證實為可靠的實驗室空間消毒方式，但仍存在一定的缺陷[14,15]。甲醛熏蒸時，對消毒環(huán)境有一定的要求，實驗室空間溫度和濕度的變化直接影響消毒效果；其次，當環(huán)境溫度較低時，甲醛蒸汽容易在微環(huán)境表面凝結(jié)成白色結(jié)晶，不易清除，從而對實驗室環(huán)境和儀器產(chǎn)生較大損傷；熏蒸結(jié)束后，殘余的甲醛氣體對人體具有致癌作用，對操作者和環(huán)境極不友好[16]。其他消毒劑如環(huán)氧乙烷等也存在對實驗室環(huán)境不友好等諸多缺點。因此，缺點較少的過氧化氫在實驗室微環(huán)境消毒中的應用越來越受關注，并不斷推出新技術。

表4過氧化氫干霧采用消毒程序4對生物安全柜表面不同細菌的殺滅效果

Tab.4 Effect of H2O2dry-mist on killing bacteria with procedure 4 in the biosafety cabinet

Bacterium (CFU)Negative controlA locationB locationPositive controlE. coli 1×108+——— 1×107+——— 1×106+——— 1×105+———S. aureus 1×108+++— 1×107+++— 1×106+——— 1×105+———S. epidermidis 1×108+++— 1×107+++— 1×106+——— 1×105+———M. smegmatis 1×107+++— 1×106+——— 1×105+——— 1×104+———

Negative control, the filter paper containing bacteria (100 μ l) without disinfection; Positive control, the filter paper containing bacteria (100 μ l) sterilized by autoclave (121 ℃, 15 min). A and B locations: the right/left site of the BSC surface for laying indicator bacteria (E.coli,S.aureus,S.epidermidisandM.smegmatis). Each bacterial strain had 3 repeats at four CFU levels (10 times dilution) on the plates (12 wells) laying on the A and B locations. The filter papers containing bacterial spores disinfected by H2O2dry-mist with procedure 4 (generate H2O2dry-mist for 1 min for 8 cycles and suspend for 5 min, and then sterilize for 2 h). The filter papers containing bacterial spores were cultured in the medium for 24 h. Observe turbidity of the culture. The turbid cultures (+) indicated bacteria growing on the papers. Oppositely, the limpid cultures (-) indicated papers being sterilized.

過氧化氫消毒可分為普通擦拭、霧化、蒸汽及低溫等離子體方式[7,11,17-19]。后兩者的應用條件比霧化過氧化氫更加嚴苛，在實驗室應用中成本較高，難以推廣。因此，霧化過氧化氫更常用于實驗室消毒。霧化過氧化氫是在外加能量作用下，液體在氣體環(huán)境中變成小霧滴的物理過程，液滴粒徑1～1 000 μ m。產(chǎn)生霧化的方式有很多，如通過普通噴壺、氣溶膠發(fā)生器、霧化超聲器等。霧化粒徑越小，消毒效果越好。當粒徑<10 μ m時，液滴在空間中不會沉降，不會聚合產(chǎn)生大液滴，且能進行無規(guī)則運動，與表面接觸后會反彈而不破裂。干霧能形成很好的空間擴散和表面接觸效果，更有利于發(fā)揮消毒作用[11,20-22]。

在生物安全柜內(nèi)進行實驗操作過程中，病原微生物易產(chǎn)生氣溶膠，污染生物安全柜內(nèi)微環(huán)境，擦拭消毒時有些部位不易接觸到，當操作抵抗力強的病原微生物(如結(jié)核分枝桿菌等)時潛在的生物安全風險更大。當常規(guī)實驗結(jié)束后或污染事故(如意外潑灑)發(fā)生時，必須進行生物安全柜內(nèi)表面和空間的消毒，及時清除污染，避免微生物污染擴散，防止實驗室內(nèi)感染事件發(fā)生[1]。本文研究了過氧化氫干霧發(fā)生器對生物安全柜微環(huán)境表面病原微生物的消毒效果。這些微生物包括大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌， 常用的滅菌微生物指示菌枯草芽胞桿菌和嗜熱脂肪芽胞桿菌， 以及作為結(jié)核分枝桿菌模擬菌的恥垢分枝桿菌。生物安全柜內(nèi)微環(huán)境過氧化氫干霧消毒結(jié)果顯示，枯草芽胞桿菌對該消毒方法的敏感度高于嗜熱脂肪芽胞桿菌：當過氧化氫干霧濃度達到15 ppm時，可殺滅1×106CFU枯草芽胞桿菌，而殺滅1×106CFU嗜熱脂肪芽胞桿菌則須達60 ppm。不同細菌的芽胞對氧化氫干霧敏感度的差異有待進一步研究。通過研究發(fā)現(xiàn)消毒程序?qū)ο拘Ч哂兄匾绊?，尤其是發(fā)散循環(huán)次數(shù)直接影響過氧化氫干霧的殺菌效果。本文建立了生物安全柜內(nèi)微環(huán)境過氧化氫干霧的消毒程序：發(fā)散1 min，間隔5 min，循環(huán)8次，達60 ppm后，消毒120 min。過氧化氫干霧可完全殺滅1×106CFU枯草芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌及1×108CFU大腸埃希菌。雖然過氧化氫干霧可殺滅1×106CFU金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和恥垢分枝桿菌，但對這3種病原微生物1×107CFU則無法完全殺滅。因此，建議在進行過氧化氫干霧消毒前，必須用消毒劑對生物安全柜表面進行擦拭或?qū)σ鐬⒉课贿M行局部消毒，以降低局部污染微生物的濃度，以期徹底殺滅生物安全柜微環(huán)境中污染的病原微生物。

圖2過氧化氫干霧采用消毒程序2對生物安全柜表面的殺菌效果

Fig.2 Effect of H2O2dry-mist on killing bacterial spores with procedure 2 in the biosafety cabinet

圖3過氧化氫干霧采用消毒程序4對生物安全柜表面的殺菌效果

Fig.3 Effect of H2O2dry-mist on killing bacterial spores with procedure 4 in the biosafety cabinet

圖4過氧化氫干霧采用消毒程序4對生物安全柜表面不同細菌的殺滅效果

Fig.4 Effect of H2O2dry-mist on killing bacteria with procedure 4 in the biosafety cabinet

通過過氧化氫干霧對生物安全柜微環(huán)境表面和空間的消毒效果，針對常規(guī)實驗及高濃度病原微生物污染情況，本文提出了相應的過氧化氫干霧消毒方案，以保障實驗室生物安全。此外，生物安全實驗室空間的消毒也是風險控制的關鍵環(huán)節(jié)，以后將進一步研究過氧化氫干霧對實驗室空間中常見微生物的消毒效果，摸索針對實驗室空間的有效過氧化氫干霧消毒程序，完善生物安全實驗室污染控制方案。

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