對人腸道病毒及其感染的再認(rèn)識

滕崢，張曦

上海市疾病預(yù)防控制中心, 上海 200336

根據(jù)國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)分類，人腸道病毒(human enterovirus，HEV)屬小RNA病毒科(Picornaviridae)中的腸道病毒屬。HEV在外環(huán)境中普遍存在，室溫下可存活數(shù)日，污水和糞便中可存活數(shù)月，冰凍條件下可保存數(shù)年。隱性感染者和患者是HEV感染的主要傳染源，也是造成疾病傳播難以控制的主要原因之一。HEV的流行地區(qū)極為廣泛。不同種類和型別的HEV感染的流行季節(jié)不完全相同，高峰季節(jié)為夏秋季。人體對不同種類和型別的HEV亦可重復(fù)感染。雖然各年齡段均可受累，但學(xué)齡前兒童患者的比例顯著高于青少年和成年人。

1 HEV的發(fā)現(xiàn)歷史及其分類

HEV的分離經(jīng)歷了從靈長類動物開始轉(zhuǎn)至小動物及應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的漫長過程。1909年，將脊髓灰質(zhì)炎患者的糞便標(biāo)本接種于猴子體內(nèi)，首次鑒定了脊髓灰質(zhì)炎病毒。1948年，用接種乳鼠方法分離到柯薩奇病毒。1951年，通過細(xì)胞培養(yǎng)分離到多種?？刹《尽３c人類健康有關(guān)的HEV(包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、?？刹《?各血清型別外，1969年后研究者又陸續(xù)分離出一些抗原性不同于以往的HEV。ICTV決定將從HEV68型起的新型HEV按序號命名。目前世界公認(rèn)的HEV有近70個血清型[1-3]，100多個基因型[4,5]。

目前，HEV的分類方式有基于血清中和試驗(yàn)的傳統(tǒng)分類法和基于HEV-VP1核甘酸序列的基因型別分類法(血清型和基因型分組見表1)。傳統(tǒng)分類法經(jīng)ICTV第8次會議反復(fù)修訂后，將?？刹《?3型與9型合并為埃可病毒9型，埃可病毒8型與1型合并為?？刹《?型，柯薩奇病毒A15型與A11型合并為柯薩奇病毒A11型，柯薩奇病毒A18型與A13型合并為柯薩奇病毒A13型，?？刹《?4型與柯薩奇病毒A24型合并為柯薩奇病毒A24型變種，鼻病毒87型重歸為HEV68型。?？刹《?0型、22型、23型和HEV72型被劃撥到其他病毒屬。隨著基因檢測技術(shù)的發(fā)展，各國研究者陸續(xù)開展用分子分型技術(shù)尋找對應(yīng)HEV血清型的研究，以便能高通量、快速地鑒定。經(jīng)過近10年的努力，分子分型技術(shù)不僅可替代傳統(tǒng)的HEV血清型鑒定技術(shù)，還可發(fā)現(xiàn)變異株和重組株，為HEV基因型別分類和免疫學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。

表1人腸道病毒傳統(tǒng)分類和基因分類匯總表[3,5]

Tab.1Traditionalclassificationandgeneclassificationofhumanenterovirus

Traditional classificationVirusSerotypeGene classificationVP1 genotypingSerotypePoliovirus (PV)1-3 (3)HEV-ACVA2-8,10,12,14,16; HEV71,76,89-92 (17)Coxsackievirus A (CVA)1-14,16,17,19-22,24 (21)HEV-BECHO1-7,9,11-21,24-27,29-33;CVB1-6;CVA9;HEV69,73-75,77-88,93,97,98,100,101,106,107 (58)Coxsackievirus B (CVB)1-6 (6)HEV-CPV1-3;CVA1,11,13,17,19-22,24;HEV95,96,99,102-105,109 (20)Echovirus (ECHO)1-7,9,11-21,24-27,29-33 (28)HEV-DHEV68,70,94 (3)New enterovirus68-71 (4)UndeterminedHEV106,108,112,113 (4)

2 HEV的傳播途徑

HEV在自然環(huán)境中長期存在。當(dāng)攜帶HEV的糞便污染了地表水、地下水、土壤及生活廢棄物時，人類食用的海產(chǎn)品、谷物、飲用水及其他食品就有HEV被富集而受污染的可能。意大利[6]、摩洛哥[7]研究者對蚌進(jìn)行HEV檢測，約在10%蚌標(biāo)本中檢測到HEV。墨西哥研究者[8]對牡蠣進(jìn)行檢測，42%標(biāo)本HEV陽性。美國夏威夷研究者[9]在9個海灘采樣點(diǎn)中6個點(diǎn)的貝類檢測到HEV，22份再循環(huán)水處理點(diǎn)標(biāo)本中11份HEV檢測陽性。我國深圳龍崗區(qū)研究者[10]做了一項(xiàng)外環(huán)境水體中HEV的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)水體中HEV總檢出率為88.2%。武漢[11]調(diào)查結(jié)果顯示，源水中46%、飲用水中21%檢測出HEV。全球脊髓灰質(zhì)炎監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室全年對環(huán)境中HEV進(jìn)行監(jiān)測和評估，盡管許多國家沒有報道急性弛緩性麻痹(acute flaccid paralysis，AFP)病例，但從環(huán)境中可檢測到脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗株。在中國內(nèi)地，水體中HEV年平均檢出率為30%左右。一旦這些被HEV污染的水或食物處理不當(dāng)就會通過人體口腔、呼吸道、黏膜等進(jìn)入靶器官復(fù)制，引發(fā)相應(yīng)的疾病。近年來，研究者還發(fā)現(xiàn)了傳播HEV的其他途徑。2006年，臺灣Chang等[12]從母乳中分離到柯薩奇病毒B3型。2008年，美國Maus等[13]從一位新生兒敗血癥患兒母親的母乳中分離到?？刹《?8型，進(jìn)一步證實(shí)母乳也能傳播HEV的事實(shí)。傳播途徑的多樣性也是HEV難以預(yù)防和控制的原因之一。

3 目前常用的HEV檢測技術(shù)

1950年前，分離和鑒定HEV的方法只有通過動物實(shí)驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)，并分離了脊髓灰質(zhì)炎病毒和柯薩奇病毒。1950年后，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展使HEV研究領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了第1次飛躍[14]，也為HEV血清型的鑒定奠定了基礎(chǔ)。1985年，美國PE-Cetus公司的人類遺傳研究室 Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR), 使人們夢寐以求的體外無限擴(kuò)增核酸片段的愿望成為現(xiàn)實(shí)。從此，常見又具有特異臨床表現(xiàn)的HEV血清型快速篩查手段得以發(fā)展。

3.1 病毒分離與鑒定

病毒分離與鑒定的標(biāo)本來自于受到攻擊的靶器官/組織和相關(guān)體液。不同血清型的HEV其結(jié)合細(xì)胞的受體有所不同，故使用多種細(xì)胞用于病毒分離可提高病毒培養(yǎng)的靈敏度、增強(qiáng)病毒感染滴度。常用的HEV分離的敏感細(xì)胞有Vero、Hep-2、HeLa、RD等。雖然該技術(shù)也存在缺陷(對柯薩奇病毒A組的病毒很難分離，沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，耗時，耗人力，不能滿足高通量和快速篩查的需要)，但到目前為止，細(xì)胞培養(yǎng)和依賴于細(xì)胞培養(yǎng)的中和試驗(yàn)法仍是病毒分離、毒株傳代和血清型鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3,5]。近年來，研究者[15]研發(fā)了混合細(xì)胞系，目的在于通過應(yīng)用多種細(xì)胞混合培養(yǎng)，節(jié)省人力，節(jié)約標(biāo)本量；并在同一反應(yīng)體系中為病原體培養(yǎng)提供多種細(xì)胞系，提高病毒的分離成功率。

3.2 血清學(xué)試驗(yàn)

血清學(xué)試驗(yàn)并不是目前散發(fā)HEV感染病例病原診斷的常用方法之一。一般需取發(fā)病早期和恢復(fù)期雙份血清進(jìn)行中和試驗(yàn)，若血清特異性抗體有4倍及以上增加，則有診斷意義，然而臨床上獲取雙份血清存在操作上的局限性。大多數(shù)情況下，檢測患者血清特異性IgM抗體可提供目前正在感染的依據(jù)，但要考慮到健康人群中抗體高低對IgM檢測結(jié)果的影響[5]。2008年手足口病作為丙類傳染病被列入《中華人民共和國傳染病防治法》，HEV71型IgM抗體檢測試劑作為疾病早期診斷試劑，其研發(fā)工作得到進(jìn)一步推動，中國國家疾病預(yù)防控制中心參與了試劑質(zhì)量的評估[16]。結(jié)果顯示，12%的患者在發(fā)病第1天便可檢測到特異性IgM抗體，95%以上的患者在4 d后的血清中檢測到HEV71型IgM抗體，HEV71型感染與其他HEV感染的交叉反應(yīng)率約為11.4%。研究者認(rèn)為，HEV71型IgM血清學(xué)診斷可為其感染的早期診斷提供幫助。國外也有報道[17,18]在處理HEV引起的暴發(fā)事件中，HEV特異性IgM抗體檢測不失為一種快速篩查的手段。

3.3 分子分型技術(shù)

HEV基因組為單股正鏈RNA，長7.2～8.5 kb，兩端為保守的非編碼區(qū)，同源性非常高，中間為連續(xù)開放讀碼框架。此外，5′端有以共價結(jié)合的約23個氨基酸組成的病毒基因組連接蛋白(viral genome-linked protein，Vpg)，3′端帶有多聚腺苷酸(poly A)尾[19]。病毒RNA編碼4個病毒結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP4)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白。VP1、VP2和VP3均暴露在病毒衣殼的表面，VP4位于衣殼內(nèi)部。VP1區(qū)域存在HEV中和抗原決定簇位點(diǎn)[20]，這正是分子分型技術(shù)鑒定不同型別HEV的基礎(chǔ)。衣殼蛋白VP1區(qū)域具有與HEV血清型完全對應(yīng)的遺傳多樣性，VP1區(qū)域不僅可作為HEV屬內(nèi)不同血清型分類的依據(jù)，還可作為小RNA病毒科內(nèi)不同屬的分類參考。Chu等[21-23]則通過實(shí)驗(yàn)證明VP4的核甘酸序列相對保守，變異幅度僅為17.5%～24.4%，因此VP4區(qū)域也可用于分子流行病學(xué)和基因分型的研究靶片段。馬來西亞、日本、澳大利亞多國研究者[24,25]對VP1、VP2和VP4區(qū)域HEV分子分型的符合率進(jìn)行比較，HEV-A組病毒分型結(jié)果的符合率為100%。雖然VP2、VP4區(qū)域分別與VP1區(qū)域病毒分型結(jié)果高度符合，但VP2、VP4區(qū)域分型結(jié)果不能涵蓋HEV-B和HEV-C組的所有病毒。

20世紀(jì)90年代末，Oberste等[23]設(shè)計引物擴(kuò)增HEV VP1部分序列，將獲得的核甘酸序列與GenBank中的標(biāo)準(zhǔn)毒株序列進(jìn)行對比，以此來判斷HEV血清型別。自此，分子分型技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用促使HEV研究領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)第2次飛躍。越來越多的研究者對HEV VP1區(qū)域擴(kuò)增引物進(jìn)行改良和修飾[5]。到目前為止，對傳統(tǒng)法可鑒定的血清型，分子分型技術(shù)同樣可鑒定出來，且獲得更多的基因型別，這為HEV的變異研究拓展了方向。近年來，美國疾病預(yù)防控制中心已用分子分型技術(shù)替代了傳統(tǒng)的中和試驗(yàn)法，從而對HEV血清型進(jìn)行快速篩查和鑒定。

4 HEV感染引起的疾病

HEV侵入呼吸道、咽喉和腸道，先在局部黏膜和咽、扁桃體等淋巴組織和腸道集合淋巴結(jié)中初步增殖，然后釋放入血，形成第1次病毒血癥，隨后擴(kuò)散至帶有受體的靶器官，再次增殖，引起第2次病毒血癥和臨床癥狀。大多數(shù)HEV感染引發(fā)的是溫和的自限性疾病，少數(shù)可引起重癥甚至死亡。不同種類和型別的HEV受體不完全相同，因此一種血清型的HEV可引發(fā)多種疾病，一種疾病可由多種血清型的HEV引起[26]。多數(shù)HEV的受體在組織和細(xì)胞中廣泛分布，包括神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心臟、皮膚/黏膜、肌肉、胰腺、腎上腺等靶器官，引起腦(膜)炎、支氣管炎、心肌炎、手足口病、弛緩性麻痹、糖尿病等疾病(表2)。全球流行病與傳染病資源信息顯示，1948年起英國就有HEV暴發(fā)，每年全球包括發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家均有HEV暴發(fā)的報道，至今已有228個國家報道了HEV暴發(fā)事件。最常見的疾病有手足口病、腦(膜)炎和急性呼吸道感染性疾病。

表2腸道病毒相關(guān)疾病

Tab.2Diseasesassociatedwithhumanenteroviruses

Clinical syndromes PoliovirusCoxsackievirus A Coxsackievirus B EchovirusParalytic diseases++++Aseptic meningitis++++Myocarditis++++Neonatal enterovirus diseases--++Epidemic pleurodynia--++Herpangina-+--Epidemic conjunctivitis-+--Acute respiratory diseases++++Fever of unknown origin++++Type 1 diabetes mellitus--+-

4.1 手足口病

手足口病中主要病原體為HEV71型和柯薩奇病毒A16型，少數(shù)病例由柯薩奇病毒A4、A5、A7、A9、A10、B5、B6型引起[27-32]。多見于5歲以下兒童。病毒侵犯口腔黏膜或皮膚上皮細(xì)胞，導(dǎo)致口腔潰瘍性損傷和皮膚斑丘疹。早期表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力，可出現(xiàn)噴嚏、咳嗽、流涕等感冒樣癥狀，也可出現(xiàn)食欲減退、惡心、嘔吐、腹痛等胃腸道癥狀。其特征性表現(xiàn)為痛性口腔潰瘍和無痛性皮膚斑丘疹?？谇粷円话阍?～7 d內(nèi)緩解，皮膚斑丘疹一般在5～10 d內(nèi)結(jié)硬皮并逐漸消失。絕大多數(shù)手足口病患者預(yù)后良好，病死率低于1%。有中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和肺臟并發(fā)癥的重型患者是手足口病死亡的高危人群。中國自1981年上海報道手足口病以來，各省每年均有散發(fā)和暴發(fā)病例。2008年安徽阜陽暴發(fā)手足口病后，因病死率高而引起廣泛重視，衛(wèi)生部將手足口病列入法定丙類傳染病進(jìn)行監(jiān)管。近幾年來，除HEV71型和柯薩奇病毒A16型仍是手足口病散發(fā)、聚集和暴發(fā)的最常見病原體外，在法國[33]、美國[34]及我國部分地區(qū)均出現(xiàn)了由柯薩奇病毒A6型、A10型感染引起的暴發(fā)事件。但手足口病的主要流行地區(qū)還是在東南亞，在越南、中國臺灣和中國內(nèi)地流行的HEV71型病毒株的基因型以C4亞型為主[35]。

4.2 病毒性腦(膜)炎

全球流行病與傳染病資源信息顯示，HEV性腦膜腦炎以?？刹《竞涂滤_奇病毒引起的為主，占非脊髓灰質(zhì)炎型HEV性腦膜腦炎的90%以上。約半數(shù)病毒性腦膜炎或腦膜腦炎暴發(fā)由?？刹《?0型引起。美國不同地區(qū)文獻(xiàn)資料顯示[36-39]，HEV感染引發(fā)的腦(膜)炎占無菌性腦(膜)炎的5%左右。印度研究者[40]匯總了2009～2010年的資料，顯示HEV引發(fā)的腦(膜)炎病例占全部腦(膜)炎病例的25%。北京[41]1996年的一項(xiàng)調(diào)查中顯示，兒童急性腦(膜)炎中15.5%是由HEV引起的。在甘肅省[42]用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測病毒性腦(膜)炎標(biāo)本中HEV IgM，陽性率為8.75%。在上海對診斷疑似乙型腦炎的2004、2005和2010年患者的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行HEV核酸檢測，陽性率為30%左右。由于目前各地區(qū)對HEV引起的腦(膜)炎檢測的標(biāo)本種類和采樣年齡不同，所以檢測結(jié)果差距較大。2007年起，我國的云南、山東，以及西班牙和印度都報道了新型HEV75型感染導(dǎo)致的病毒性腦(膜)炎病例[43-45]，因此HEV引起的病毒性腦(膜)炎越來越受重視。

HEV感染引起的腦(膜)炎多見于兒童，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛和腦膜刺激等癥狀，多數(shù)呈輕型，在1周內(nèi)完全恢復(fù)，通常無明顯不良后果；但腦膜腦炎可留中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。2008年手足口病進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)直報以后，腦膜刺激癥狀為判斷手足口病重癥的標(biāo)準(zhǔn)之一。

4.3 呼吸系統(tǒng)疾病

許多國家如美國、德國、韓國、日本等將HEV視作普通感冒或流行性感冒樣病例的重要病原體。2008～2010年，亞洲、歐洲和美國相繼報道新型HEV68型導(dǎo)致的支氣管炎和肺炎[46]。北京首都兒科研究所2007年[47]報道，在402份標(biāo)本中檢出70份HEV陽性，陽性率為17.4%；下呼吸道感染HEV陽性率為17.7%，上呼吸道感染HEV陽性率為15.9%。近幾年來，也出現(xiàn)了HEV109型引起的兒童急性呼吸道感染的報道[48,49]，陽性檢出率分別為1.1%和1.6%。

5 展望

HEV分布廣泛、種類繁多，引起的疾病呈多樣性。雖然5歲以下兒童更易受到HEV的侵犯，但全年齡組人群都會受到不同種類HEV的感染而引發(fā)相應(yīng)疾病。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，變異及重組HEV對人類健康的威脅正被不斷報道。近3年來，全球范圍內(nèi)包括美國、墨西哥、英國、中國、新加坡、印度等均有手足口病暴發(fā)的報道，常見的病原體除HEV71型和柯薩奇病毒A16型外，柯薩奇病毒A6型和A10型引起的手足口病暴發(fā)日漸增多。自2010年起，全球范圍內(nèi)由HEV68型引起的感染也時有發(fā)生，通常引起呼吸道感染。近5年的國內(nèi)外文獻(xiàn)資料顯示，非脊髓灰質(zhì)炎型HEV性腦膜腦炎占病毒性腦膜腦炎的35%～80%。

鑒于HEV的型別多、所致疾病多樣化，今后如能加強(qiáng)臨床與基礎(chǔ)結(jié)合的病因?qū)W研究，將有可能發(fā)現(xiàn)新的HEV型別及疾病。為提高全民意識、提升臨床醫(yī)師的認(rèn)知及減輕HEV感染導(dǎo)致的隱性疾病負(fù)擔(dān)，加強(qiáng)對HEV的監(jiān)測和篩查不容忽視。此外，根據(jù)HEV的共有特點(diǎn)，研發(fā)共有的疫苗與藥物也是值得重視的切入點(diǎn)。

[1] 郭紅梅. 腸道病毒感染的快速診斷技術(shù)[J].國外醫(yī)學(xué)·流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊, 2000, 27(4):162-164.

[2] Bingjun T, Yoshida H, Yan W, Lin L, Tsuji T, Shimizu H, Miyamura T. Molecular typing and epidemiology of non-polio enteroviruses isolated from Yunnan Province, the People’s Republic of China [J]. J Med Virol, 2008, 80(4):670-679.

[3] Muir P, K?mmerer U, Korn K, Mulders MN, P?yry T, Weissbrich B, Kandolf R, Cleator GM, van Loon AM. Molecular typing of enteroviruses: current status and future requirements [J]. Clin Microbiol Rev, 1998, 11(1):202-227.

[4] Yamashita T, Ito M, Tsuzuki H, Sakae K, Minagawa H. Molecular identification of enteroviruses including two new types (EV98 and EV107) isolated from Japanese travelers from Asian countries [J]. J Gen Virol, 2010, 91(Pt 4):1063-1066.

[5] Nasri D, Bouslama L, Pillet S, Bourlet T, Aouni M, Pozzetto B. Basic rationale, current methods and future directions for molecular typing of human enterovirus [J]. Expert Rev Mol Diagn, 2007, 7(4): 419-434.

[6] Bendinelli M, Ruschi A. Isolation of human enterovirus from mussels [J]. Appl Microbiol, 1969, 18(3):531-532.

[7] Karamoko Y, Ibenyassine K, Mhand RA, Idaomar M, Ennaji MM. Assessment of enterovirus contamination in mussel samples from Morocco [J/OL]. World J Microbiol Biotechnol, 2006, 22(2):105-108. http://www.deepdyve.com/lp/springer-journals/assessment-of-enterovirus-contamination-in-mussel-samples-from-morocco-9bawRlBO4n.

[8] Shieh YC, Baric RS, Woods JW, Calci KR.Molecular surveillance of enterovirus and norwalk-like virus in oysters relocated to a municipal-sewage-impacted gulf estuary [J]. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(12): 7130-7136.

[9] 謝顯清，劉鳳仁，譚惠玲，陳應(yīng)堅，李輝，黃麗雯，劉福益，劉松.深圳市龍崗區(qū)外環(huán)境水體中腸道病毒的污染情況調(diào)查[J]. 河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2011, 22(3):168-169.

[10] Connell C, Tong HI, Wang Z, Allmann E, Lu Y.New approaches for enhanced detection of enteroviruses from Hawaiian environmental waters. [J]. PLoS One, 2012, 7(5):e32442.

[11] Ye XY, Ming X, Zhang YL, Xiao WQ, Huang XN, Cao YG, Gu KD. Real-time PCR detection of enteric viruses in source water and treated drinking water in Wuhan, China [J]. Curr Microbiol, 2012, 65(3):244-253.

[12] Chang ML, Tsao KC, Huang CC,Yen MH, Huang CG, Lin TY. Coxsackievirus B3 in human milk [J]. Pediatr Infect Dis J, 2006, 25(10)：955-957.

[13] Maus MV, Posencheg MA, Geddes K, Elkan M, Pearanda S, Oberste MS, Hodinka RL. Detection of echovirus 18 in human breast milk [J]. J Clin Microbiol,2008,46(3):1137-1140.

[14] 王禎祥. 醫(yī)學(xué)病毒學(xué)基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京：科學(xué)出版社，1990.

[15] 汪千力，居麗雯，蔣露芳，蔡韻，高穎陽，姜慶五. MDCK、HEp-2、Vero細(xì)胞混合凍存適用于分離培養(yǎng)常見病毒研究[J]. 中華疾病控制雜志, 2012, 16(10):827-832.

[16] Xu F, Yan Q, Wang H, Niu J, Li L, Zhu F, He S, Zhang S, Weng Z, Cheng T, Cai Y, He D, Chen Y, Ge S, Yeo AE, Zhang J, Ng MH, Xia N.Performance of detecting IgM antibodies against enterovirus 71 for early diagnosis [J]. PLoS One, 2010, 5(6): e11388.

[17] Alexander JP Jr, Chapman LE, Pallansch MA, Stephenson WT, T?r?k TJ, Anderson LJ. Coxsackievirus B2 infection and aseptic meningitis: a focal outbreak among members of a high school football team [J]. J Infect Dis, 1993, 167(5): 1201-1205.

[18] Goldwater PN. Immunoglobulin M capture immunoassay in investigation of coxsackievirus B5 and B6 outbreaks in South Australia [J]. J Clin Microbiol, 1995, 33(6): 1628-1631.

[19] Rhoades RE, Tabor-Godwin JM, Tsueng G, Feuer R. Enterovirus infections of the central nervous system [J]. Virology, 2011 411 (2):288-305.

[20] 沈俊婭，范駿. 腸道病毒衣殼蛋白致病性研究進(jìn)展[J]. 國際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志, 2009,36(5):340-342.

[21] Chu PY, Lin KH, Hwang KP, Chou LC, Wang CF, Shih SR, Wang JR, Shimada Y, Ishiko H. Molecular epidemiology of enterovirus 71 in Taiwan [J]．Arch Virol，2001, 146(3):589-600．

[22] Shih SR, Ho MS, Lin KH, Wu SL, Chen YT, Wu CN, Lin TY, Chang LY, Tsao KC, Ning HC, Chang PY, Jung SM, Hsueh C, Chang KS. Genetic analysis of enterovirus 71 isolated from fatal and non-fatal cases of hand，foot and mouth disease during an epidemic in Taiwan, 1998 [J]．Virus Res, 2000, 68(2):127-136．

[23] Oberste MS, Maher K, Kilpatrick DR, Pallansch MA. Molecular evolution of the human enteroviruses: correlation of serotype with VP1 sequence and application to picornavirus classification [J]. J Virol, 1999, 73(3):1941-1948.

[24] Perera D, Shimizu H, Yoshida H, Tu PV, Ishiko H, McMinn PC, Cardosa MJ. A comparison of the VP1, VP2, and VP4 regions for molecular typing of human enteroviruses [J]. J Med Virol, 2010, 82(4):649-657.

[25] Casas I, Palacios GF, Trallero G, Cisterna D, Freire MC, Tenorio A. Molecular characterization of human enteroviruses in clinical samples: comparison between VP2, VP1, and RNA polymerase regions using RT nested PCR assays and direct sequencing of products [J]. J Med Virol, 2001,65(1):138-148.

[26] Stalkup JR, Chilukuri S. Enterovirus infections: a review of clinical presentation, diagnosis, and treatment [J]. Dermatol Clin, 2002, 20(2):217-223.

[27] Flewett TH, Warin RP, Clarke SK. ‘Hand, foot, and mouth disease’ associated with Coxsackie A5 virus [J]. J Clin Pathol, 1963, 16(1):53-55.

[28] Russo DH, Luchs A, Machado BC, Carmona Rde C, Timenetsky Mdo C. Echovirus 4 associated to hand, foot and mouth disease [J]. Rev Inst Med Trop Sao Paulo, 2006,48(4):197-199.

[29] Abubakar S, Chee HY, Shafee N, Chua KB, Lam SK. Molecular detection of enteroviruses from an outbreak of hand, foot and mouth disease in Malaysia in 1997 [J]. Scand J Infect Dis, 1999, 31(4):331-335.

[30] Hooi PS, Chua BH, Lee CS, Lam SK, Chua KB. Hand, foot and mouth disease: University Malaya Medical Centre experience [J]. Med J Malaysia,2002, 57(1):88-91.

[31] Chan LG, Parashar UD, Lye MS, Ong FG, Zaki SR, Alexander JP, Ho KK, Han LL, Pallansch MA, Suleiman AB, Jegathesan M, Anderson LJ. Deaths of children during an outbreak of hand, foot, and mouth disease in Sarawak, Malaysia: clinical and pathological characteristics of the disease. For the outbreak study group [J]. Clin Infect Dis, 2000, 31(3):678-683.

[32] Shekhar K, Lye MS, Norlijah O, Ong F, Looi LM, Khuzaiah R, Marzuki I, Hussein I, Wong SL, Mohan J, Sinniah M, Abu Bakar S. Deaths in children during an outbreak of hand, foot, and mouth disease in Peninsular Malaysia—clinical and pathological characteristics [J]. Med J Malaysia, 2005, 60(3):297-304.

[33] Mirand A, Henquell C, Archimbaud C, Ughetto S, Antona D, Bailly JL, Peigue-Lafeuille H. Outbreak of hand, foot and mouth disease/herpangina associated with coxsackievirus A6 and A10 infections in 2010, France: a large citywide, prospective observational study [J]. Clin Microbiol Infect, 2012, 18(5): E110-E118.

[34] Centers for Disease Control and Prevention (CDC).Notes from the field: severe hand, foot, and mouth disease associated with coxsackievirus A6 Alabama, Connecticut, California, and Nevada, November 2011-February 2012 [J]. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 2012, 61(12):213-214.

[35] Huang SW, Kiang D, Smith DJ, Wang JR. Evolution of re-emergent virus and its impact on enterovirus 71 epidemics [J]. Exp Biol Med (Maywood), 2011, 236(8):899-908.

[36] King RL, Lorch SA, Cohen DM, Hodinka RL, Cohn KA, Shah SS.Routine cerebrospinal fluid enterovirus polymerase chain reaction testing reduces hospitalization and antibiotic use for infants 90 days age or younger [J]. Pediatrics, 2007, 120(3):489-496.

[37] Dupuis M, Hull R, Wang H, Nattanmai S, Glasheen B, Fusco H, Dzigua L, Markey K, Tavakoli NP. Molecular detection of viral causes of encephalitis and meningitis in New York State [J]. J Med Virol, 2011,83(12):2172-2181.

[38] Tavakoli NP, Wang H, Nattanmai S, Dupuis M, Fusco H, Hull R.Detection and typing of enteroviruses from CSF specimens from patients diagnosed with meningitis/encephalitis [J]. J Clin Virol, 2008, 43(2):207-211.

[39] Harvey SM, Gonzalze AH. Enterovirus detection as a result of West Nile virus surveillance [J]. Am J Clin Pathol, 2007, 128(6):936-938.

[40] Kumar A, Shukla D, Kumar R, Idris MZ, Misra UK, Dhole TN. Molecular epidemiological study of enteroviruses associated with encephalitis in children from India [J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(11):3509-3512.

[41] Xu Y, Zhaori G, Vene S, Shen K, Zhou Y, Magnius LO, Wahren B, Linde A. Viral etiology of acute childhood encephalitis in Beijing diagnosed by analysis of single samples [J]. Pediatr Infect Dis J, 1996,15(11):1018-1024.

[42] 王旭霞，蔣建祥，王芳，張曉曙，于德山，汪鵬，趙海，李慧. 2009年-2011年甘肅省病毒性腦炎流行病學(xué)及主要臨床癥狀分析[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 46(12):1099-1102.

[43] 田炳均，吳燕，張東華，何麗芳，丁崢嶸，陸林.新型腸道病毒EV75的分子生物學(xué)鑒定[J]. 中華流行病學(xué)雜志, 2007，28(7):725-726.

[44] Reina-González G, Pérez-Ruiz M, Avellón A, Trallero G, Otero A, de la Rosa-Fraile M, Jiménez-Valera M, Navarro-Marí JM. Enterovirus 75, a new pathogenic virus in Granada province (Spain) [J]. Enferm Infect Microbiol Clin, 2007, 25(9):566-569.

[45] Lewthwaite P, Perera D, Ooi MH, Last A, Kumar R, Desai A, Begum A, Ravi V, Shankar MV, Tio PH, Cardosa MJ, Solomon T. Enterovirus 75 encephalitis in children, southern India [J]. Emerg Infect Dis, 2010, 16(11):1780-1782.

[46] Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Clusters of acute respiratory illness associated with human enterovirus 68—Asia, Europe, and United States, 2008-2010 [J]. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 2011, 60(38): 1301-1304.

[47] 伏瑾，袁藝，孫麗萍，崔小岱. 北京地區(qū)兒童急性呼吸道感染與腸道病毒關(guān)系探討[J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志, 2007，21(4)：316-318.

[48] Pankovics P, Boros A, Szabó H, Székely G, Gyurkovits K, Reuter G. Human enterovirus 109 (EV109) in acute paediatric respiratory disease in Hungary [J]. Acta Microbiol Immunol Hung, 2012, 59(2):285-290.

[49] Yozwiak NL, Skewes-Cox P, Gordon A, Saborio S, Kuan G, Balmaseda A, Ganem D, Harris E, DeRisi JL. Human enterovirus 109: a novel interspecies recombinant enterovirus isolated from a case of acute pediatric respiratory illness in Nicaragua [J]. J Virol, 2010, 84(18):9047-9058.