自體成肌細胞甲杓肌注射治療創(chuàng)傷性聲門關閉不全的實驗研究

閆飚 孫敬武 鄒嘉平 張磊

創(chuàng)傷性聲門關閉不全多指多種原因引起的聲帶麻痹或聲帶外傷疤痕形成后， 聲帶體積減小，聲門閉合不全，導致聲音嘶啞、呼吸困難、發(fā)音無力及誤咽等[1]，如果不及時治療可能導致聲帶及甲杓肌萎縮，文獻報道這類聲帶運動障礙如果三個月不能恢復正常，自愈的可能性不大，應視為手術適應癥[2]。自體組織聲帶注射是近年常用的治療聲門閉合不全的有效方法。骨骼肌成肌細胞是干細胞的一種，位于成人肌肉表面，以衛(wèi)星細胞存在[3]，又稱為衛(wèi)星細胞，具有其他干細胞所具有的基本特征。近年來成肌細胞移植己由實驗階段[4～6]初步走向臨床應用，移植途徑主要為直接注射[7，8]。最近有學者[9，10]用帶有熒光標記的成肌細胞注入去神經支配的聲帶肌，結果注入的成肌細胞活性增加且與去神經的肌纖維廣泛融合。本研究擬通過甲杓肌注射自體成肌細胞治療一側聲帶失去喉返神經支配且疤痕萎縮致聲門閉合不全的實驗研究，觀察萎縮的聲帶容積及甲杓肌直徑的變化，探討其對創(chuàng)傷性聲門關閉不全的療效。

1 材料與方法

1.1實驗動物及材料 20只成年新西蘭大白兔，雌雄不限，體重1.5～2.0 kg，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

主要試劑及儀器：D-BPS 、DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBCO公司)，bFGF(美國GIBCO 公司), 胎牛血清(Hylcone公司)，透明質酸酶，鏈酶蛋白酶，胰蛋白酶( Sigma公司) ，一抗：Rabbit anti-Desmin， Rabbit anti-SMA(博奧森)，SABC試劑盒，DAB顯色試劑盒(Zymed)。顯微鏡CX-40 (日本 Olympus公司)圖象分析系統(tǒng)Motic image advanced(3.2北京)。

1.2創(chuàng)傷性聲門閉合不全動物模型的建立 20只動物均在無菌條件下于第2～4氣管環(huán)水平切除左側喉返神經1 cm，近心端結扎并縫于皮下，同時取出左側胸鎖乳突肌(供成肌細胞培養(yǎng)用)縫合切口；再在直達喉鏡下，暴露聲門，細鉤針于左側聲帶表面劃痕，深度達聲帶肌層，制成創(chuàng)傷性聲門關閉不全的模型。

1.3骨骼肌成肌細胞混懸液的制作 將取出的實驗兔左側胸鎖乳突肌，轉入超凈臺，采用兩步消化法和非連續(xù)密度梯度離心法分離及純化成肌細胞，并進行培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)。按SABC試劑盒說明書的方法對培養(yǎng)的細胞進行結蛋白免疫組化染色。

1.4骨骼肌成肌細胞注射 建立動物模型12周后，20只大白兔隨機分成A、B兩組，每組10只，細胞移植前兩組動物均連續(xù)1周腹腔注射免疫抑制劑環(huán)孢菌素A 50 mg·kg-1·d-1。動物以2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后，支撐喉鏡暴露聲門，顯微鏡下以喉顯微注射器將成肌細胞混懸液(0.3 ml)注射于A組兔左側萎縮聲帶中部及聲帶突旁甲杓肌內(注射時稍過量，使矯正的聲帶越過中線，聲帶游離緣擴散成一光滑輪廓)，B組同法于左側聲帶注射等量的生理鹽水。注射完畢后兩組動物均腹腔注射1周環(huán)孢菌素A50 mg·kg-1·d-1。兩組動物均以右側聲帶為正常對照。注射12周后觀察兩組動物雙側甲杓肌纖維直徑和對應聲帶體積。

1.5甲杓肌組織形態(tài)學觀察 自體成肌細胞注射殺死實驗兔，取出雙側甲杓肌，行橫、縱切面切片，片厚4 μm，常規(guī)行HE染色及免疫組化染色。于光鏡下分別觀察雙側甲杓肌肌纖維的大體形態(tài)，橫截面積，纖維數(shù)量及細胞核數(shù)的變化，肌原纖維、胞核的分布及形態(tài)變化等。用Motic image advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)測定標本肌纖維橫截面積，每張切片中測量100個肌細胞的直徑，自動計算均數(shù)。

1.6聲帶體積的測量 切取動物雙側聲帶，吸去表面血液，放入一毫升注射器中，加入生理鹽水達到一毫升刻度，然后把這些生理鹽水注入到另一個一毫升注射器中，測得體積，一毫升減去所得的生理鹽水體積即為聲帶的體積。

1.7統(tǒng)計學方法 用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據進行分析。自體甲杓肌直徑和聲帶體積的變化用配對資料的t檢驗，組間甲杓肌直徑和聲帶體積的比較用獨立樣本資料的t檢驗。

2 結果

20只大白兔在實驗過程中均無自然死亡。

2.1成肌細胞培養(yǎng)結果 培養(yǎng)48小時后成肌細胞呈扁平狀,胞漿十分豐富,折光性強。4～5天后逐漸展現(xiàn)細胞形態(tài)，早期細胞呈梭形或紡錘形，多為骨骼肌成肌細胞，隨細胞生長時間的延長，成肌細胞增殖且相互融合并逐漸沿一個方向平行排列，逐漸形成多核的肌管，且鋪滿瓶底。骨骼肌源性中間絲蛋白desmin在成肌細胞胞質中呈強陽性表達，胞質染色呈棕色或棕黃色，成纖維細胞及其他雜質細胞不著色(圖1)。

2.2甲杓肌組織形態(tài)學觀察 成肌細胞注射12周后可見兩組右側甲杓肌(正常對照側)HE染色見肌纖維橫切面呈圓形或不規(guī)則多邊形，粗大，多核，肌纖維斷面呈細點狀，核位于肌膜邊緣；縱切面肌漿內有許多與細胞長軸平行排列的肌原纖維，排列較整齊。正常對照側甲杓肌纖維平均直徑為72±10.43 μm。

B組左側甲杓肌嚴重萎縮，肌纖維形態(tài)散亂，大小各異，可見斷裂纖維相，核減少，可見核固縮深染或呈鏈狀排列，可見少量膠原纖維增生(圖2)。B組左側甲杓肌肌纖維平均直徑54±8.76 μm。

圖1 成肌細胞desmin表達(SABC×200)圖2 B組成肌細胞注射12周后甲杓肌橫截面HE染色(×200)圖3 B組成肌細胞注射12周后甲杓肌橫截面desmin表達(SABC×200)圖4 A組成肌細胞注射12周后甲杓肌橫截面desmin表達(SABC×200)

A組左側甲杓肌肌膜核排列漸整齊，呈鏈狀，核聚集減少，肌原纖維松散，肌纖維間界限不清。較正常對照組纖維結締組織增生、炎癥細胞浸潤明顯，部分區(qū)域存在大量的混雜不清的細胞及膠原纖維，其中可見淋巴細胞、分葉狀核的中性細胞及毛細胞血管增多。A組左側甲杓肌肌纖維平均直徑72±11.60 μm。

2.3甲杓肌免疫組化染色鏡下觀察 B組左側甲杓肌縱切面肌纖維粗細不等，形狀不一，肌纖維明顯萎縮，排列不整齊，間距大小不等，肌纖維周圍成肌細胞較少；甲杓肌橫切面見肌纖維橫截面大多呈不規(guī)則型，大小不一，肌纖維間有的界限不清，甚至相互融合，肌纖維周圍成肌細胞較少，可見desmin表達較弱(圖3)；A組左側甲杓肌縱切面肌纖維粗細基本相等，形狀基本相同，肌纖維較粗，排列整齊，間距大小基本相等，肌纖維周圍成肌細胞較多；肌纖維橫截面積多呈圓形或長方形，粗細相差不大，肌纖維之間界限基本清楚，肌纖維周圍成肌細胞較多并且基本呈均勻分布，可見desmin表達較強(圖4)。

2.4聲帶體積和甲杓肌直徑測量結果 兩組聲帶體積測量結果見表1，甲杓肌直徑測量結果見表2，可見，A組聲帶體積和甲杓肌直徑均大于B組(P<0.05)，而與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。A組左側聲帶體積平均0.258±0.025 ml，B組平均0.221±0.0227 ml，正常對照側平均0.257±0.0156 ml。

表1 A、B兩組左側聲帶注射12周后及正常對照側的聲帶體積(ml)

注：與B組比較，t=3.4，P<0.05

表2 A、B兩組左側聲帶注射12周后及正常對照側甲杓肌纖維平均直徑

注：與B組比較，t=3.75，P<0.05

3 討論

骨骼肌受周圍神經的支配，肌肉的長期運動及其結構和功能的維持都依靠相應運動神經纖維的調節(jié)。Sunderlang[11]發(fā)現(xiàn)運動神經元與骨骼肌細胞之間還存在其他復雜關系，這些關系是不依賴于神經沖動的。肌細胞維持正常的形態(tài)結構需要一些神經營養(yǎng)因子的作用，如失神經支配時，首先表現(xiàn)為肌纖維直徑和橫截面積的改變。既往研究[12]表明肌纖維橫截面積于失神經2個月時下降70%，其后逐漸減緩，于4個月時下降80%，最終橫截面積可以減少80% ～ 90%。本研究切斷了實驗動物左側喉返神經可使聲帶失神經支配而萎縮，同時以銳器創(chuàng)傷同側聲帶使之疤痕形成后更加重了聲帶的萎縮，便于更好地觀察甲杓肌注射自體成肌細胞后對創(chuàng)傷性聲門閉合不全的治療效果。結果顯示，注射生理鹽水的B組術側甲杓肌的肌纖維直徑和聲帶體積較正常對照組明顯縮小，而注射自體成肌細胞的A組術側與健側及B組相比較，甲杓肌纖維直徑和聲帶體積等縮小不明顯，說明甲杓肌注射成肌細胞可以有效防治其肌肉萎縮。

一般情況下成肌細胞處于靜止狀態(tài)，一旦肌肉受創(chuàng)傷，成肌細胞即被激活，進入有絲分裂周期，彼此融合且與受損的肌纖維融合以保持和恢復骨骼肌結構和功能的完整。本研究中，A組左側甲杓肌和聲帶未發(fā)生明顯萎縮，可能與以下因素有關：①注射后的成肌細胞具有一定的移行潛能，成肌細胞可以存活并分化為骨骼肌肌纖維；②存活的成肌細胞可通過局部分泌細胞因子特別是生長因子刺激甲杓肌干細胞的產生和聲帶上皮細胞增生完成自身修復，產生更多的功能細胞。

本研究結果顯示自體成肌細胞的提取和體外增殖成功，說明制備自體成肌細胞切實可行。自體成肌細胞注射12周后甲杓肌肌纖維周圍成肌細胞明顯增多，說明注射的成肌細胞已成活并與宿主細胞很好的融合，一方面注射的成肌細胞使甲杓肌在失神經支配時直徑增加，另一方面使疤痕攣縮的聲帶體積增加，可有效的治療聲門閉合不全。說明自體成肌細胞甲杓肌注射對創(chuàng)傷性聲門關閉不全的治療具有可行性，但其具體機制還需進一步探索。

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