內耳注射藥物建立新生鼠耳聾動物模型*

胡凌翔 吳皓 石復辛

最新病理學研究證明耳蝸毛細胞缺失或死亡為新生兒非遺傳性聾的主要原因之一[1]，因此，重新生成或替代毛細胞功能為其理想的治療策略[2]。毛細胞再生是近年來國內外研究的熱點，轉染毛細胞基因Atoh1[3]或抑制Notch信號通路[4]可成功將新生小鼠內耳支持細胞轉化為毛細胞，但新生毛細胞是否有助于聽力提高尚有待研究。研究新生毛細胞功能需要良好的可重復的耳聾動物模型，因此，本研究的主要目的為在新生鼠內建立以毛細胞缺失為病理特征的耳聾模型。

氨基糖苷類抗生素中的新霉素有較強的耳毒性，能誘導毛細胞死亡[5]。而毛細胞死亡與氨基糖苷類抗生素的劑量呈正相關，故可采用結合利尿劑腹腔注射的方式致成年鼠毛細胞死亡[6]。然而，利用耳毒性藥物建立新生鼠耳聾動物模型的研究卻未見報道，由于用于誘導新生鼠耳蝸毛細胞死亡的氨基糖苷類藥物的劑量接近其致死量，故本研究擬使用微量注射系統在內耳直接給藥的方式建立新生鼠耳聾模型，為今后進行毛細胞再生的研究提供技術手段。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 實驗動物選用ICR懷孕母鼠，購買自上海SIPPR-BK試驗動物有限公司。于孕18天購買，待新生鼠出生。出生后，將42只新生鼠按注射速度、液體種類及藥物濃度不同分組(表1)，各組新生鼠于出生后第二天(P2)接受手術并內耳注射給藥，于術后第1天(P3，Neo 50 1組)或術后第3天(P5，其余各組)處死，取耳蝸基底膜鋪片染色，觀察毛細胞改變。其中，對照組(Ctl)在術中僅用玻璃電極穿刺耳蝸底回側壁，未注射液體。

表1 各組動物只數、注射總量、給藥速度、藥物濃度及處死時間

1.2內耳注射方法 新生鼠采用低溫麻醉，包埋于冰中麻醉后，術區(qū)以碘伏和70%酒精消毒，置于冰袋上，取右側臥位，在手術顯微鏡下，以顯微剪于距左耳后溝1 mm處剪開皮膚，皮下組織稍向兩側分離后，以微型眼科動物撐開器撐開皮膚，即可見到胸鎖乳突肌，稍向下分離下頜下腺后可見面神經，撐開胸鎖乳突肌和下頜下腺，暴露白色耳環(huán)后緣，輕輕挑開并向前推移，暴露耳蝸側壁及鐙骨動脈，輕輕推開鐙骨動脈下方膜性組織，將連接玻璃微電極(尖端直徑15～20 μm)直接穿刺耳蝸底回外側壁，利用納升級顯微注射系統(UMP3+MICRO4+NANOFIL,WPI Co.)將蒸餾水或新霉素素溶液(1、10、50、100 μmol/ml)按照各組動物的給藥標準(表1)分別注入各組動物耳蝸，注射完畢停留約15秒后拔出玻璃微電極尖，將耳蝸側壁的膜性組織復位，并將耳后切口復位，無須縫合。因注射給藥時間不足3.5分鐘，故總體手術時間約在7分鐘左右完成。注射完成拔出玻璃電極后，因其直徑較小，未見明顯內淋巴液自耳蝸穿刺部位溢出。消毒后迅速將小鼠置于50 ℃保溫箱復溫，待蘇醒后移至37 ℃母鼠籠中飼養(yǎng)至處死。

1.3耳蝸基底膜鋪片及染色：手術后一天(P3)或三天(P5)新生鼠斷頭處死，迅速分離手術側耳蝸，置入4%多聚甲醛溶液固定。浸泡30～60分鐘后，

于PBS溶液中，在體視顯微鏡下分離耳蝸(由于新生鼠頭部多為軟骨，且耳蝸周圍經手術解剖產生疤痕，需在體視顯微鏡下分離耳蝸，以免破壞耳蝸結構)，分離基底膜組織。經PBS溶液漂洗2遍后，行免疫熒光染色?；啄ぶ萌胍豢谷芤褐杏? ℃孵育過夜(0.1%Triton,1%BSA,5%驢血清，Proteus公司兔Myo7a多抗1:300，Santa Cruz公司羊Sox2多抗1:300)。PBS溶液漂洗3次后，置入熒光二抗(Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit 1:500，Alexa Fluor 594 Donkey anti-Goat1:500; Invitrogen公司)室溫2小時染色。漂洗3遍后抗淬滅封片劑封片。

1.4顯微鏡觀察及圖像處理 使用徠卡DMI3000B熒光顯微鏡下觀察基底膜改變并拍攝圖像，Adobe Photoshop CS6進行后期圖像處理。

1.5統計學方法 采用OFFICE EXCEL 2010進行數據統計及統計學差異分析。首先采用F檢驗行樣本方差檢驗，然后采用T檢驗比較組間差異，以P<0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1內耳注射術后新生鼠的一般情況及耳蝸解剖所見 在P2時，小鼠對待低溫麻醉耐受力好，在低溫狀態(tài)下，可耐受手術5～10分鐘，手術后經及時復溫，新生鼠可在3～5分鐘內蘇醒。手術傷口較小，長度不足0.5厘米，可不縫合，亦未見明顯出血。傷口一般術后第一天粘連，至P5處死時已基本愈合。術后新生鼠發(fā)育如正常鼠，體重增加，42例均成活，個別可見因低溫凍傷所致尾巴末端萎縮。

術后耳蝸大體改變：取材時見耳后切口干燥清潔，留有痂皮，傷口已粘連，無紅腫化膿表現。耳蝸解剖分離時，可見手術傷口部粘連較重，和正常新生鼠比較，較難從顳骨中完整剝離耳蝸，須用顯微剪仔細剔除耳蝸鼓岬外側粘連分離。耳蝸底回外側壁已完全愈合，未見進針點。P5時耳蝸有部分鈣化，但無需脫鈣即可完成分離基底膜結構。

2.2毛細胞機械性損傷與注射速度呈正相關 以不同速度注射蒸餾水后3天，可見，在20、60 nl/min速度下，耳蝸內、外毛細胞數量略有減少，但差異無明顯統計學意義(圖1)。從圖2可見，在不同注射速度下，內毛細死亡較少，外毛細胞死亡也僅局限于耳蝸底回注射區(qū)域。

圖1不同速度下耳蝸注射純水后，毛細胞數量比較

圖2單純穿刺及不同速度注射蒸餾水3天后耳蝸基底膜鋪片a：僅針刺耳蝸底回，未見毛細胞死亡；b：20 nl/min純水注射200 nl，僅見注射部位若干外毛細胞死亡，無內毛細胞死亡；c：60 nl/min純水注射200 nl，注射部位外毛細胞死亡多于內毛細胞

2.3毛細胞損傷與新霉素濃度呈正相關 以60 nl/min的速度，給予新生鼠耳蝸內分別注射1、10、50、100 μmol的新霉素200 nl后3天，與對照組相比，1 μmol/ml(Neo1組)新霉素可誘導23%的外毛細胞死亡但內毛細胞無顯著變化；10 μmol/ml(Neo10組)誘導27%的外毛細胞和8.5%內毛細胞死亡；50 μmol/ml(Neo50組)、100 μmol/ml(Neo100組)可分別誘導外毛細胞死亡數量約68%和74%，內毛細胞約達80%和85%，并存在明顯差異(P<0.05)。Neo1、10、50、100組外毛細胞數量變化存在明顯差異(P<0.05)。與同樣速度注射純水組(H2O 60組)相比，Neo50、100組內、外毛細胞數量均明顯減少(圖3)。

圖3 不同濃度新霉素注射后3天，各組毛細胞數量比較(*與對照組比較，P<0.05；#與H2O 60組比較，P<0.05)

不同濃度新霉素內耳注射后，內、外毛細胞死亡均由底回向頂回蔓延，50和100 μmol/ml可誘導底回和中回內、外毛細胞全部死亡。其中高濃度下(Neo50、100組)內毛細死亡較外毛細胞明顯，而低濃度下(Neo1、10組)則相反(圖4)。

2.4新霉素快速誘導毛細胞死亡 以60 nl/min的速度，給予新生鼠耳蝸內注射50 μmol/ml的新霉素200 nl后1天(Neo50 1組)基底膜觀察，內、外毛細胞已大量死亡，與新霉素給藥后3天(Neo50組)相比內毛細胞(P=0.38)、外毛細胞(P=0.5)數量差異無統計學意義(圖5、6)。

圖4 1、10、50、100 μmol新霉素注射3天后耳蝸基底膜鋪片a： 1 μmol/ml、b：10 μmol/ml底回注射，可見底回內、外毛細胞均有損傷；c：50 μmol/ml、d 100 μmol/ml底回注射，可見僅剩頂回內、外毛細胞存活

圖5 Neo50組(術后3天)與Neo501組(術后1天)毛細胞數量比較

2.5新霉素對支持細胞無影響 50 μM新霉素，以60 nl/min、總量200 nl注入新生鼠耳蝸后3天(Neo50組)，可見內、外毛細胞有明顯死亡，底回、中回完全死亡，僅剩頂回部分毛細胞依舊存活；而耳蝸支持細胞(Sox2+)分布均勻，無明顯死亡(圖7)。

3 討論

研究顯示，小鼠耳蝸毛細胞對氨基糖苷類抗生素的抵抗力似乎比人類要高[7]。在小鼠中，使用氨基糖苷類抗生素與利尿劑結合，建立的藥物性聾模型為耳聾的發(fā)病機制及治療的研究打下了基礎。利

圖6新霉素50 μmol/ml內耳注射后1天耳蝸基底膜鋪片底、中回大部分內、外毛細胞死亡，中回近頂回位置毛細胞死亡中

圖7 Neo50組新生鼠耳蝸基底膜鋪片a：注射新霉素50 μmol/ml后3天，僅殘余頂回毛細胞；b：支持細胞形態(tài)完好；c：合并圖像

尿劑的使用一方面使血液濃縮，使耳蝸供血減少造成短期的缺血缺氧損傷；同時，由于血管紋系統的這種損傷，使血-迷路屏障開放，從而使氨基糖苷類抗生素能更多地進入外淋巴液，進而進入內淋巴被毛細胞攝取，造成內耳損傷[8]。然而，這一致聾方法似乎并不適用于新生鼠。在成年鼠，大劑量利尿劑與氨基糖苷類抗生素聯合應用對腎臟的嚴重毒性可能是致死性的，有報道稱這一方法的致死率高達50%[7]，推測新生鼠的致死率更高。為了進一步開展新生兒毛細胞再生的研究，建立有效新生鼠耳聾動物模型非常必要[2]，因此本研究嘗試通過內耳給藥致聾的方法來建立新生鼠耳聾動物模型。

研究顯示，與單純針刺耳蝸底回比較，在分別以20、60 nl/min注射200 nl純水后，由基底膜鋪片可見，在注射部位，僅有個別外毛細胞損傷，但內、外毛細胞的總數無顯著性差異。Stover等[9]報道比較通過圓窗或底回開窗的方式使病毒轉染豚鼠耳蝸，兩者術后5天ABR反應閾均無明顯升高。然而，在Iizuka等[10]的研究中，新生鼠通過耳蝸底回開窗的方式轉染病毒，術后ABR反應閾升高20 dB。耳蝸開窗后對聽力的影響可能與開窗的大小及腦脊液瘺、注射液體的種類、注射速度及注射總量有關。從文中結果看，采用耳蝸底回微創(chuàng)打孔內耳給藥法后，內毛細胞無明顯變化，而外毛細胞僅注射部位有個別死亡，且觀察到，單純針刺方法不會出現內、外淋巴液滲漏，在限定的速度和總量下對內耳結構無顯著影響。推測本研究所采用的給藥方法本身對聽力的影響很小。

在內耳毛細胞再生領域的研究中，既殺傷毛細胞，又保證支持細胞完好，從而提供毛細胞再生的來源是及其重要的前提。本研究結果顯示，即使內耳注射高濃度新霉素后，毛細胞殘留頂回部分，而整個耳蝸基底膜的支持細胞分布均勻，形態(tài)較好。這可能與氨基糖苷類抗生素進入毛細胞并殺傷毛細胞的機制有關。支持細胞可能缺乏類似毛細胞的MET(mechano-electrical transduction)離子通道[11,12]，或者其不表達Myosin7a[13～15]，從而阻止了氨基糖苷類抗生素對其的毒性作用。

本研究通過對新生鼠內耳直接給藥的方法，建立了有效的新生鼠耳聾模型。這種采用耳蝸底回微創(chuàng)打孔技術，通過微泵對耳蝸底回中階進行微量注射的內耳給藥方法，對內耳結構無顯著損傷。本實驗所采用的新霉素內耳給藥方法，可誘導特異性的、快速而較完全的毛細胞死亡，對內耳支持細胞卻無影響，為今后進行毛細胞再生研究打下基礎，同樣這種內耳微量注射方法可應用于內耳給藥及基因治療的研究及臨床工作。

4 參考文獻

1 Amatuzzi M,Liberman MC,Northrop C.Selective inner hair cell loss in prematurity: a temporal bone study of infants from a neonatal intensive care unit[J].J Assoc Res Otolaryngol,2011,12:595.

2 Ronaghi M,Nasr M,Heller S.Concise review: Inner ear stem cells——an oxymoron,but why[J]? Stem Cells,2012,30: 69.

3 Zheng JL,Gao WQ.Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears[J].Nature Neuroscience,2000,3:580.

4 Lin V,Golub JS,Nguyen TB,et al.Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles[J].J Neurosci,2011,31:15 329.

5 Matz GJ.Aminoglycoside cochlear ototoxicity[J].Otolaryngologic Clinics of North America,1993,26:705.

6 熊浩，禇漢啟，黃孝文，等.卡那霉素聯合呋塞米快速誘導小鼠耳蝸損傷[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2010,45:222.

7 Hirose K,Sato E.Comparative analysis of combination kanamycin-furosemide versus kanamycin alone in the mouse cochlea[J].Hearing Research,2011,272:108.

8 Liu H,Ding DL,Jiang HY,et al.Ototoxic destruction by co-administration of kanamycin and ethacrynic acid in rats[J].J Zhejiang Univ Sci(B),2011,12:853.

9 Stover T,Yagi M,Raphael Y.Cochlear gene transfer: round window versus cochleostomy inoculation[J].Hearing Research,1999,136:124.

10 Iizuka T,Kanzaki S,Mochizuki H,et al.Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea[J].Human Gene Therapy,2008,19:384.

11 Marcotti W,van Netten SM,Kros CJ.The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels[J].Journal of Physiology,2005,567:505.

12 Steyger PS,Peters SL,Rehling J,et al.Uptake of gentamicin by bullfrog saccular hair cells in vitro[J].Journal of the Association for Research in Otolaryngology,2003,4:565.

13 Richardson GP,Forge A,Kros CJ,et al.Myosin VIIA is required for aminoglycoside accumulation in cochlear hair cells[J].Journal of Neuroscience,1997,17:9 506.

14 Hasson T,Gillespie PG,Garcia JA,et al.Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia[J].Journal of Cell Biology,1997,137:1 287.

15 Kros CJ,Marcotti W,van Netten SM,et al.Reduced climbing and increased slipping adaptation in cochlear hair cells of mice with Myo7a mutations[J].Nature Neuroscience,2002,5:41.