水楊酸鈉致耳鳴大鼠的行為學(xué)及聽性腦干反應(yīng)改變*

陳抗松 廖華 楊希林 陳建新 解為全 吳莎

耳鳴是耳科臨床最常見的癥狀之一，耳鳴與心理因素密切相關(guān)，嚴(yán)重耳鳴可能使患者產(chǎn)生煩惱、焦慮、抑郁等不良情緒且在無意識(shí)中不斷增強(qiáng)，繼而耳鳴被感知為令人厭煩的信號(hào)，使精神緊張或抑郁加劇并形成惡性循環(huán)的條件反射[1]。為了研究耳鳴產(chǎn)生的機(jī)制，Jastreboff最先提出了經(jīng)典的水楊酸致耳鳴動(dòng)物模型，之后大量研究證實(shí)此動(dòng)物模型用于耳鳴研究是可行的[2，3]。為了解耳鳴對精神行為的影響，本實(shí)驗(yàn)采用目前動(dòng)物精神心理研究中最常用的行為學(xué)方法[4]評(píng)估水楊酸致耳鳴大鼠模型的抑郁焦慮行為改變，并觀察其聽力的變化，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 通過曠場實(shí)驗(yàn)[4]，選取行為學(xué)指標(biāo)得分相近、耳廓反應(yīng)靈敏的18只成年Wistar雄性大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，體重200～280 g，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物隨機(jī)分為對照組、水楊酸組和鹽水組，每組6只。對照組不予處理，水楊酸組每天上午8：00給予350 mg/kg[2，3]水楊酸鈉(購自Sigma公司)腹腔注射1次，共注射28天，鹽水組每天同一時(shí)間腹腔注射相同劑量的生理鹽水，共注射28天。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物耳鳴的行為學(xué)檢測 參照J(rèn)astreboff[4]經(jīng)典驗(yàn)證動(dòng)物耳鳴的飲水抑制法，并在此基礎(chǔ)上將足部電擊改為嘴部電擊。在大鼠形成“聲音出現(xiàn)-飲水開始，聲音消失-飲水停止”的條件反射后停止訓(xùn)練并開始注射水楊酸鈉，條件反射消退期1～3天測量飲水抑制率(R)，R=B/(A+B),其中B為條件刺激(背景噪聲停止)期1 min內(nèi)大鼠的飲水次數(shù)，A為條件刺激之后1 min內(nèi)大鼠飲水次數(shù)。

1.2.2曠場行為學(xué)測量 曠場實(shí)驗(yàn)(可反映動(dòng)物的抑郁焦慮行為)參照Elliott等[5]的方法，自制大小為120 cm×90 cm×35 cm的曠場，四周和底壁均為黑色，底壁等分為9個(gè)40 cm×30 cm的方格，位于正中的為中央格，于上午8：00～12:00在安靜、光線及溫度適宜的房間內(nèi)進(jìn)行觀察。使用動(dòng)物行為自動(dòng)跟蹤系統(tǒng)(Ethovision3.0,荷蘭)記錄并分析大鼠在曠場內(nèi)10 min的總行程、平均速度、直立次數(shù)(動(dòng)物雙前足離開底面為標(biāo)志，無論動(dòng)物站立多長時(shí)間直至放下雙前足為1次)、中央格停留時(shí)間及糞便粒數(shù)。在造模前1天、第14、28天對每只動(dòng)物進(jìn)行檢測，每只大鼠檢測時(shí)將其置于中央格內(nèi)，完畢后清理曠場內(nèi)的糞便，用75%的酒精徹底清潔消毒曠場，待酒精揮發(fā)后，再進(jìn)行下一只測試。

1.2.3體重及攝食量的變化 在造模第28天稱取各組大鼠的體重及24 h攝食量，減去造模前一天的體重和攝食量為各組大鼠的體重和攝食量的改變。

1.2.4糖水偏愛實(shí)驗(yàn) 參照Willner[6]的方法，在造模前1天和第28天進(jìn)行糖水偏愛實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)在安靜的房內(nèi)，每籠(單籠喂養(yǎng))同時(shí)給兩個(gè)均裝有1%蔗糖水的小瓶訓(xùn)練動(dòng)物飲用糖水；隨后24小時(shí)，每籠再同時(shí)給兩小瓶水，一瓶裝1%蔗糖水，一瓶裝純凈水；禁食水24小時(shí)后再同時(shí)給每只大鼠定量好的兩小瓶水，一瓶為1%蔗糖水，一瓶為純凈水，1小時(shí)后取走小瓶并稱重，記錄動(dòng)物的糖水消耗、純水消耗并計(jì)算糖水偏愛[糖水消耗/(糖水消耗+純水消耗)×100%]。

1.2.5ABR測試 注射水楊酸鈉前1天、注射第7、14、28天，在曠場檢測完成后對水楊酸組大鼠在屏蔽隔聲室內(nèi)行ABR測試。按45 mg/kg劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后置于固定架上，記錄電極插于大鼠耳間線中點(diǎn)顱頂皮下，參考電極插于給聲耳乳突皮下，地線插于鼻尖，采用TDT(美國TDT公司)系統(tǒng)SigGenRP軟件單耳給聲并采集信號(hào)，刺激聲為click，強(qiáng)度范圍為10～110 dB SPL，衰減間隔5 dB，濾波帶寬300～3 000 Hz，持續(xù)時(shí)間10 ms，疊加1 024次，記錄ABR的反應(yīng)閾及80 dB SPL時(shí)各波的潛伏期和波間期。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPASS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩獨(dú)立樣本的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；重復(fù)測量的計(jì)量資料采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠耳鳴行為學(xué)檢測結(jié)果 經(jīng)過5天的適應(yīng)性訓(xùn)練，三組大鼠的飲水抑制率均小于0.2，且R值趨于穩(wěn)定，條件反射消退期1～3天水楊酸組大鼠的R值明顯高于對照組和鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明本實(shí)驗(yàn)耳鳴動(dòng)物模型造模成功。

2.2各組大鼠曠場行為的改變(表1) 實(shí)驗(yàn)前各組大鼠的曠場行為(運(yùn)動(dòng)總行程、速度、直立次數(shù)、中央格停留時(shí)間、糞便數(shù)量)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第14天，水楊酸組與其它兩組比較，其運(yùn)動(dòng)總行程、平均速度和直立次數(shù)均減少，糞便粒數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中央格停留時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；鹽水組與對照組比較，各曠場行為差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第28天，水楊酸組與其它兩組比較，曠場行為差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，鹽水組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3注射水楊酸鈉第28天各組大鼠體重、攝食量、24 h液體消耗量、糖水偏愛的改變(表2) 水楊酸組與鹽水組和對照組比較，大鼠的體重增長緩慢，攝食量減少，24 h液體消耗量減少，對糖水的偏愛減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；鹽水組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4水楊酸組大鼠ABR的改變(表3) 水楊酸組大鼠注射水楊酸鈉前ABR反應(yīng)閾為36.67±4.08 dB SPL，注射第7天，各波潛伏期和波間期與注射前相比稍延長，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；注射第14天與注射前和第7天比較，波Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ潛伏期均延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而各波間期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；注射第28天與注射前和第7天比較，各波潛伏期及Ⅲ-Ⅴ、Ⅰ-Ⅴ波間期延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而Ⅰ-Ⅲ波間期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與第14天比較，各波潛伏期和Ⅰ-Ⅲ波間期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而Ⅲ-Ⅴ、Ⅰ-Ⅴ波間期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠不同時(shí)間曠場行為的比較

注：*與對照組和鹽水組同期比較，P<0.05

表2 注射水楊酸鈉第28天各組大鼠體重、攝食量、總液體消耗量、糖水偏愛的比較

注：*和鹽水組與對照組比較，P<0.05

表3 水楊酸組大鼠水楊酸鈉注射前后ABR各波潛伏期、波間期和反應(yīng)閾的比較

注：#與注射前比較，P<0.05;△與注射第7天比較，P<0.05;*與注射第14天比較，P<0.05

3 討論

長期耳鳴可能會(huì)引發(fā)患者抑郁、焦慮、記憶力減退等癥狀，邵茵等[7]采用漢密頓焦慮量表和漢密頓抑郁量表對1 240例耳鳴患者的臨床表現(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中有不良心理反應(yīng)者占89.6%，心情煩躁者占83.8%，影響睡眠者占63.7%，注意力難以集中者占30.3%；方祎等[8]用勞拉西泮(一種常用的苯二氮卓類抗焦慮藥)結(jié)合耳鳴咨詢與聲治療，發(fā)現(xiàn)其可顯著改善耳鳴患者的耳鳴癥狀和焦慮情緒，支持Jastreboff提出的耳鳴神經(jīng)生理學(xué)模型；孫華等[9]使用抗抑郁藥氟西汀治療不伴聽力損失的耳鳴患者，證實(shí)氟西汀可使耳鳴的療效明顯提高，伴隨抑郁情緒的顯著改善，提示耳鳴與抑郁之間有一定的關(guān)聯(lián)，可能有共病現(xiàn)象存在。

目前精神心理研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常以曠場實(shí)驗(yàn)、糖水偏愛實(shí)驗(yàn)評(píng)估動(dòng)物的抑郁焦慮行為變化，以判斷是否產(chǎn)生精神行為異常。曠場實(shí)驗(yàn)是指通過觀察動(dòng)物(尤其是嚙齒類動(dòng)物)進(jìn)入到一個(gè)四周封閉的空曠場地中產(chǎn)生的行為變化，研究其情緒的過程，由Hall于1934年首次提出并應(yīng)用于情緒方面的研究，目前已發(fā)展成為動(dòng)物心理學(xué)方面尤其是抑郁、焦慮方面最常用評(píng)估方法之一[10]。中央格停留時(shí)間反映動(dòng)物對環(huán)境的認(rèn)知能力，正常動(dòng)物會(huì)避開空曠環(huán)境，迅速離開中央格，沿周邊活動(dòng)，如果對新環(huán)境的認(rèn)知能力較差，則停留在中央格的時(shí)間延長[10]。從文中結(jié)果看，隨著用藥時(shí)間的延長，三組大鼠中央格停留時(shí)間縮短，可能與動(dòng)物對曠場的適應(yīng)有關(guān)，但水楊酸組大鼠注射第28天中央格停留時(shí)間明顯延長(P<0.05)，說明長期注射水楊酸對大鼠的認(rèn)知能力產(chǎn)生了一定影響；水平活動(dòng)和垂直活動(dòng)反映動(dòng)物的探索行為、興奮性和運(yùn)動(dòng)水平，水楊酸組與正常組和鹽水組比較，總行程和平均速度顯著下降(P<0.05)，而鹽水組與對照組比較，所有曠場行為指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)，表明腹腔注射生理鹽水對大鼠的行為影響非常小，而注射水楊酸對大鼠的探索性、興奮性及運(yùn)動(dòng)性產(chǎn)生一定的抑制作用；糖水消耗量、糖水偏愛百分比是測量抑郁癥模型動(dòng)物快感缺乏的有效客觀指標(biāo)，動(dòng)物總的液體消耗量不變而糖水飲用量下降說明動(dòng)物對幸福事件反應(yīng)能力下降[11]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與抑郁癥大鼠模型的糖水偏愛實(shí)驗(yàn)結(jié)果[10]接近?？傊?，本實(shí)驗(yàn)中的水楊酸組大鼠與對照組相比，糖水消耗減少，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)水平活動(dòng)、垂直活動(dòng)減少，侵犯攻擊能力下降、攝食減少、體重增長減緩等與抑郁癥者的精神運(yùn)動(dòng)改變、興趣或快感缺失有一定的相似性，說明耳鳴可能引起焦慮、抑郁，因此，以上行為學(xué)觀察方法在一定上程度上反映了耳鳴對生物體情緒的影響。

有研究提示，不伴聽力損失的耳鳴患者的ABR各波潛伏期延長[12]；Barnea等[13]認(rèn)為ABR對于耳鳴的診斷無意義，而Lemaire等[14]發(fā)現(xiàn)耳鳴患者ABR波Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波幅下降和波間期延長，且與聽力損失的程度無關(guān)；Liu等[3]對注射水楊酸大鼠行ABR檢測，發(fā)現(xiàn)多次注射水楊酸鈉的大鼠ABR各波波幅下降，且隨著注射水楊酸鈉的時(shí)間延長其ABR反應(yīng)閾不斷上升，各波潛伏期不斷延長。本實(shí)驗(yàn)中，腹腔注射水楊酸第14、28天，水楊酸組大鼠各波潛伏期和波間期均顯著延長(P<0.05)，且以波Ⅴ的改變最顯著(P<0.01)，而注射水楊酸第7天與實(shí)驗(yàn)前比較無明顯改變，表明長期注射水楊酸鈉可導(dǎo)致大鼠外周聽覺神經(jīng)至腦干通路的神經(jīng)電活動(dòng)異常，但這種改變是否是耳鳴產(chǎn)生的原因有待進(jìn)一步的研究。

目前關(guān)于耳鳴與精神行為異常的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)，但其發(fā)生機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)將評(píng)估動(dòng)物精神心理異常的行為學(xué)方法應(yīng)用于耳鳴動(dòng)物模型的研究，對耳鳴大鼠模型的曠場行為進(jìn)行了詳細(xì)的記錄和分析，為耳鳴與精神心理異常關(guān)系的研究提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，下一步將在分子生物學(xué)方面對大鼠耳鳴與精神異常的關(guān)系進(jìn)行探討。

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