沉默HIF-2α表達(dá)對低氧下乳腺癌干細(xì)胞微球體富集的影響

屈洪波 范原銘 韓明利 陳 鑫 吳誠義 湯為學(xué)

低氧微環(huán)境不僅參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成等調(diào)控，而且亦抑制腫瘤干細(xì)胞及腫瘤相關(guān)間質(zhì)干細(xì)胞分化［1-2］。盡管目前尚未獲得腫瘤干細(xì)胞特異性標(biāo)志物，但特殊的腫瘤微環(huán)境，尤其是低氧微環(huán)境可作為腫瘤干細(xì)胞治療靶點(diǎn)。研究表明，HIF-2α在維持腫瘤干細(xì)胞未分化表型中發(fā)揮重要作用［3］。下調(diào)HIF-2α介導(dǎo)的低氧信號通路將抑制腫瘤干細(xì)胞自我更新及增加對放、化療敏感性。本研究擬探討沉默HIF-2α對低氧下BCSCs微球體富集的抑制作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株及主要試劑：乳腺癌MCF-7細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫）；慢病毒質(zhì)粒pGC-LV、pHelper1.0及pHelper2.0（上海吉?jiǎng)P基因公司）；Lipofectamine2000（美國 Invitrogen公司）；B27（1∶50）、胎牛血清及DMEM/F12（美國Gibco公司）；堿性成纖維細(xì)胞生長因子（BFGF）及表皮生長因子（EGF）（以色列ProSpec公司）；單克隆鼠抗人HIF-2α及β-actin（美國Santa Cruz公司）；HRP標(biāo)記抗鼠二抗（北京中杉金橋公司）；總蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物公司）；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Marker（大連寶生物公司）；PCR引物設(shè)計(jì)及合成（上海生工公司）。

1.2 方法

1.2.1 低氧下BCSCs微球體培養(yǎng) 取對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞，消化后重懸于添加生長因子的無血清培養(yǎng)基（serum-free medium，SFM）。SFM按常規(guī)方法配制：DMEM/F12中添加5 U/L胰島素、L-谷氨酰胺2 mmol/L、B27為1∶50、EGF 20 μg/L及BFGF 20μg/L。調(diào)整細(xì)胞密度至3×104/mL后接種于低粘附6孔板，置于低氧培養(yǎng)箱中，每3天半量或全量換液1次，約10 d傳代 1 次。低氧培養(yǎng)箱由 1%O2、94%N2、5%CO2組成，通過控制O2或N2輸入量，維持低氧微環(huán)境。

1.2.2 HIF-2α基因RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建及鑒定 設(shè)計(jì)及合成HIF-2α基因siRNA寡核苷酸序列，構(gòu)建干擾序列表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，根據(jù)HIF-2α抑制率，確定最終有效靶序列為5'-GTGA GAGTGAGTAAGGGTA-3'，由上海吉?jiǎng)P基因公司合成。寡核苷酸經(jīng)退火形成雙鏈DNA，經(jīng)T4連接酶與Age I和EcoR I雙酶切后的pGC-LV-GFP線性化載體連接，形成表達(dá)siRNA慢病毒載體，經(jīng)酶切鑒定。轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，選取重組陽性克隆行PCR鑒定。

1.2.3 MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞及第1代BCSCs微球體消化后計(jì)數(shù)，2×105/mL細(xì)胞接種于6孔板中，低氧下培養(yǎng)至30%～50%匯合時(shí)，按感染指數(shù)（MOI=20）加入HIF-2α基因RNA干擾慢病毒液，以空載體作為對照，48 h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光情況。2周后采用流式細(xì)胞術(shù)分選綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）陽性細(xì)胞。

1.2.4 RT-PCR和Western blot檢測HIF-2α mRNA及蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分為RNA干擾組（20%O2）、RNA干擾組（1%O2）、空載體組（20%O2）及空載體組（1%O2）。收集各組GFP（+）的MCF-7細(xì)胞，Trizol試劑抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。以β-actin為內(nèi)參，檢測HIF-2α mRNA表達(dá)。引物設(shè)計(jì)：β-actin上游引物為5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'，下游引物為5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'；HIF-2α上游引物為5'-ATGGTAGCCCTCTCCAACAAG-3'，下游引物為5'-AGGTTCTTCATCCGTTTCCAC-3'。設(shè)置反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性15 s，95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸5 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。收集各組細(xì)胞后，加入RIPA裂解液及PMSF，冰上靜置30 min；12 000 r/min離心10 min，BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉2 h，加一抗，4℃孵育過夜。HRP標(biāo)記的抗山羊或鼠二抗37℃孵育1.5 h，TBST洗膜后以ECL發(fā)光試劑盒顯影并曝光，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 MTT檢測MCF-7細(xì)胞增殖活性 實(shí)驗(yàn)分組同前，取對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分別在常氧和低氧下培養(yǎng)，于24、48、72、96 h加入20 μL/孔MTT（5 μg/L），培養(yǎng)4 h后棄上清，加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀570 nm測OD值，計(jì)算5個(gè)復(fù)孔平均值。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（對照孔OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值）/對照孔OD值×100%。

1.2.6 有限稀釋法檢測低氧下微球體細(xì)胞單克隆形成能力 實(shí)驗(yàn)分組同前，將空載體組及RNA干擾組慢病毒載體轉(zhuǎn)染至第1代BCSCs微球體細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，收集第2代微球體細(xì)胞，用Accutase細(xì)胞消化液消化成單個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用SFM倍比稀釋至5個(gè)/mL，接種至96孔板，置于低氧下培養(yǎng)，第2天在顯微鏡下挑選只含1個(gè)細(xì)胞的孔，做好標(biāo)記并補(bǔ)加100 μL添加生長因子的SFM；隔天觀察直徑＞75 μm或50個(gè)細(xì)胞以上克隆微球體數(shù)量，由于1個(gè)微球體代表1個(gè)干細(xì)胞起源的克隆，以微球體形成率（%）=微球體數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%計(jì)算克隆形成率。

1.2.7 RT-PCR檢測微球體細(xì)胞干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物ABCG2、CD44及OCT-4 mRNA表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組同前，細(xì)胞懸液離心后收集微球體，Trizol試劑常規(guī)抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。以β-actin為內(nèi)參，檢測ABCG2、CD44及OCT-4 mRNA表達(dá)。引物設(shè)計(jì)：β-actin上游引物為5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'，下游引物為5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'；ABCG2 上游引物為5'-AGAGTGGCTTTCTACCTTGTCG-3'，下游引物為5'-AATAACGAAGATTTGCCTCCAC-3'；CD44上游引物為5'-CATCTACCCCAGCAACCCTA-3'，下游引物為5'-ACTGTCTTCGTCTGGGATGG-3'；OCT-4上游引物為5'-GTATTCAGCCAAACGACCATCT-3'，下游引物為5'-TACTGGTTCGCTTTCTCTTTC G-3'。余下步驟同前（1.2.4所述），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HIF-2α基因RNA干擾慢病毒載體PCR鑒定及轉(zhuǎn)染

將HIF-2α基因RNA干擾載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，選取重組陽性克隆行PCR鑒定。陽性重組細(xì)菌克隆PCR產(chǎn)物大小為343 bp，以雙酶切后pGC空載體PCR產(chǎn)物大小289 bp為陰性對照，鑒定結(jié)果與預(yù)期相符（圖1）。將RNA干擾慢病毒液加至培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞，12 h后更換為完全培養(yǎng)基，48 h后可見綠色熒光蛋白表達(dá)，且表達(dá)量隨時(shí)間遞增，72 h時(shí)達(dá)最大，轉(zhuǎn)染效率＞80%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1 and 2：Negative clone group（289 bp）；3 and 4：Positive clone group（343 bp）；5 and 6：Empty vector group（289 bp）；7：Negative control group（ddH2O）；M：Marker

2.2 低氧及常氧下MCF-7細(xì)胞HIF-2α mRNA及蛋白表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示：RNA干擾組（20%O2）、RNA干擾組（1%O2）、空載體組（20%O2）及空載體組（1%O2）細(xì)胞HIF-2α mRNA表達(dá)量分別為 0.005±0.001、0.008±0.001、0.785±0.137及0.831±0.232，與空載體組比較，低氧及常氧下RNA干擾組HIF-2α mRNA表達(dá)均明顯降低（P＜0.05，圖2A）。

Western blot結(jié)果顯示：RNA干擾組（20%O2）、RNA 干擾組（1%O2）、空載體組（20%O2）及空載體組（1%O2）細(xì)胞HIF-2α蛋白表達(dá)量分別為0.062±0.012、0.065±0.021、0.175±0.131及0.376±0.236，與空載體組比較，低氧及常氧下RNA干擾組HIF-2α蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05，圖2B）。

圖2 RT-PCR和Western blot檢測各組MCF-7細(xì)胞中HIF-2α mRNA及蛋白表達(dá)Figure2 HIF-2α mRNA and protein expressions in MCF-7 cells from different groups,as detected by RT-PCR and Western blot,respectively(±s,n=3)

2.3 沉默HIF-2α對低氧下MCF-7細(xì)胞增殖活性的影響

MTT結(jié)果顯示：常氧下RNA干擾組與空載體組及未轉(zhuǎn)染組之間細(xì)胞增殖抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明 RNA 干擾 HIF-2α基因?qū)ΤＱ跸翸CF-7細(xì)胞增殖活性無影響。而低氧下RNA干擾組較未轉(zhuǎn)染組及空載體組，細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制（P＜0.05，圖3）。

圖3 MTT法檢測各組MCF-7細(xì)胞增殖抑制率Figure3 Proliferation inhibition rate of MCF-7 cells in different groups as determined by the MTT assay

2.4 沉默HIF-2α對低氧下BCSCs微球體形成的影響

倒置熒光顯微鏡結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染組，空載體組及RNA干擾組BCSCs微球體數(shù)量分別為（16±5）、（13±2）及（5±1）個(gè)，與未轉(zhuǎn)染組及空載體組比較，RNA干擾組MCF-7細(xì)胞成球率降低60%（P＜0.05，圖4A～C）。轉(zhuǎn)染組和空載體組微球體平均直徑為（225.6±3.2）μm和（189.6±2.1）μm，而RNA干擾組微球體平均直徑為（84.4±1.2）μm，RNA干擾組微球體平均直徑明顯降低（P＜0.05，圖4D～F）。

圖4 熒光顯微鏡下觀察低氧下各組MCF-7細(xì)胞微球體形成情況Figure4 Microsphere formation of MCF-7 cells for different groups under hypoxia，as observed by fluorescent microscopy

2.5 沉默HIF-2α對低氧下BCSCs相關(guān)標(biāo)志物mRNA表達(dá)影響

RT-PCR結(jié)果顯示：低氧下RNA干擾組、空載體組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞ABCG2 mRNA表達(dá)量分別為0.446±0.120、0.898±0.211及 0.865±0.126；CD44 mRNA表達(dá)量分別為 0.325±0.056、0.989±0.316及0.956±0.289；OCT-4 mRNA表達(dá)量分別為 0.517±0.214、0.843±0.231及0.817±0.211。與未轉(zhuǎn)染組及空載體組比較，RNA干擾組BCSCs相關(guān)標(biāo)志物ABCG2、CD44及OCT-4 mRNA表達(dá)均顯著降低（P＜0.05，圖5），表明沉默HIF-2α表達(dá)能有效下調(diào)BCSCs相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)。

圖5 RT-PCR檢測各組BCSCs相關(guān)標(biāo)志物mRNA表達(dá)Figure5 mRNA expressions of the BCSC markers in different groups，as assayed by RT-PCR

3 討論

低氧在腫瘤中普遍存在，腫瘤低氧抑制細(xì)胞分化、上調(diào)耐藥基因表達(dá)、選擇性抗凋亡、促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移、下調(diào)DNA修復(fù)基因表達(dá)及增加基因不穩(wěn)定性等［4-5］。隨著腫瘤干細(xì)胞及其腫瘤相關(guān)微環(huán)境研究深入［6］，研究表明，低氧不僅增強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞致瘤性，同時(shí)在維持腫瘤干細(xì)胞處于未分化表型及表觀遺傳學(xué)修飾等發(fā)揮重要作用［3，7-8］。

低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIFs）為近年來發(fā)現(xiàn)的一類介導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞內(nèi)低氧反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，廣泛表達(dá)于哺乳動物的各種組織細(xì)胞中，以促進(jìn)有機(jī)體對低氧的適應(yīng)過程，是細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄水平協(xié)調(diào)缺氧變化的最主要調(diào)節(jié)因子［9-10］。HIFs家族包括兩個(gè)重要成員，即HIF-1α和HIF-2α，兩者在功能上相似，但不完全相同［3］。其組成均含有結(jié)構(gòu)亞單位（HIF-β）和功能亞單位（HIF-α）兩部分。常氧下，HIF-α易受泛素-蛋白酶快速降解。低氧下HIF-α因無法羥基化而未被降解，與從胞漿轉(zhuǎn)移到核內(nèi)HIF-β結(jié)合形成二聚體，啟動靶基因表達(dá)產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，常氧下存在HIF-2α mRNA表達(dá)，但是在蛋白水平未見其表達(dá)，可能是常氧下HIF-2α蛋白被降解而喪失作用；而低氧可誘導(dǎo)HIF-2α蛋白表達(dá)，且泛素化降解途徑受抑制；同時(shí)非氧依賴途徑也可誘導(dǎo)HIF-2α蛋白合成［11］。MTT結(jié)果也驗(yàn)證此結(jié)論，常氧下RNA干擾組與空載體組之間細(xì)胞增殖抑制率無明顯差異，表明盡管常氧下存在HIF-2α mRNA轉(zhuǎn)錄，但在翻譯階段出現(xiàn)降解。而沉默HIF-2α表達(dá)可明顯抑制低氧下細(xì)胞增殖，且HIF-2α蛋白表達(dá)降低，表明HIF-2α具有抗凋亡作用。其抗凋亡的可能機(jī)制［12］：1）激活下游VEGF、NOS等促進(jìn)腫瘤血管生成；2）誘導(dǎo)p21和p27的活化，阻斷細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換，使細(xì)胞停滯在G1期；3）誘導(dǎo)p53基因突變及抑制Bcl-2表達(dá)；4）增加無氧代謝和葡萄糖攝取。

HIF-2α除具有與HIF-1α相似作用外，還在維持腫瘤干細(xì)胞未分化表型方面發(fā)揮重要作用。Li等［13］發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞高表達(dá)HIF-1α和或HIF-2α，沉默HIF-1α或HIF-2α可降低神經(jīng)球形成及影響膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生存，與HIF-1α相比，HIF-2α在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中表達(dá)更高。同樣，Pietras等［14］發(fā)現(xiàn)HIF-2α優(yōu)先表達(dá)于未成熟神經(jīng)脊樣神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，并維持神經(jīng)母細(xì)胞瘤未分化狀態(tài)。Hochedlinger等［15］在多西環(huán)素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)OCT-3或OCT-4高表達(dá)能抑制細(xì)胞分化，導(dǎo)致上皮組織發(fā)育不良，表明OCT-3或OCT-4參與誘導(dǎo)腫瘤生成；同時(shí)將HIF-2α敲入小鼠胚胎細(xì)胞后，結(jié)果顯示HIF-2α與OCT-3或OCT-4在轉(zhuǎn)錄水平上直接相關(guān)，而OCT-3或OCT-4轉(zhuǎn)錄因子的丟失將使得鼠胚胎干細(xì)胞源性畸胎瘤生長減慢。

本研究通過RNA干擾沉默HIF-2α在BCSCs微球體細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)微球體形成率及大小均明顯降低，同時(shí)BCSCs相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)也明顯降低，表明HIF-2α可能是調(diào)控乳腺癌細(xì)胞“干性”的重要因子，低氧具有維持BCSCs未分化表型作用。

1 Nurwidya F,Takahashi F,Minakata K,et al.From tumor hypoxia to cancer progression:the implications of hypoxia-inducible factor-1 expression in cancers[J].Anat Cell Biol,2012,45(2):73-78.

2 王秀超,苑占娜,李莎莎,等.低氧誘導(dǎo)因子-2α在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國腫瘤臨床,2011,38(10):560-563.

3 Loboda A,Jozkowicz A,Dulak J.HIF-1 and HIF-2 transcription factors-similar but not identical[J].Mol Cells,2010,29(5):435-442.

4 Noman MZ,Messai Y,Carré T,et al.Microenvironmental hypoxia orchestrating the cell stroma cross talk,tumor progression and antitumor response[J].Crit Rev Immunol,2011,31(5):357-377.

5 Zhu P,Ning Y,Yao L,et al.The proliferation,apoptosis,invasion of endothelial-like epithelial ovarian cancer cells induced by hypoxia[J].J Exp Clin Cancer Res,2010,29:124.

6 羅維遠(yuǎn),黃正接,羅 琪.乳腺癌干細(xì)胞研究的新進(jìn)展[J].中國腫瘤臨床,2011,38(23):1475-1478.

7 Persano L,Rampazzo E,Basso G,et al.Glioblastoma cancer stem cells:Role of the microenvironment and therapeutic targeting[J].Biochem Pharmacol,2012[Epub ahead of print].

8 Zeng W,Wan R,Zheng Y,et al.Hypoxia,stem cells and bone tumor[J].Cancer Lett,2011,313(2):129-136.

9 Majmundar AJ,Wong WJ,Simon MC.Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress[J].Mol Cell,2010,40(2):294-309.

10 Keith B,Johnson RS,Simon MC.HIF1α and HIF2α:sibling rivalry in hypoxic tumor growth and progression[J].Nat Rev Cancer,2011,12(1):9-22.

11 Li M,Kim WY.Two sides to every story:the HIF-dependent and HIF-independent functions of pVHL[J].J Cell Mol Med,2011,15(2):187-195.

12 Semenza GL.Hypoxia-inducible factors:mediators of cancer progression and targets for cancer therapy[J].Trends Pharmacol Sci,2012,33(4):207-214.

13 Li Z,Bao S,Wu Q,et al.Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem Cells[J].Cancer Cell,2009,15(6):501-513.

14 Pietras A,Hansford LM,Johnsson AS,et al.HIF-2alpha maintains an undifferentiated state in neural crest-like human neuroblastoma tumor-initiating cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(39):16805-16810.

15 Hochedlinger K,Yamada Y,Beard C,et al.Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues[J].Cell,2005,121(3):465-477.