羅甸縣不同種源麻風(fēng)樹抗寒生理生態(tài)學(xué)研究

歐國騰 ，詹 鵬 ，江 贏 ，石 旺 ，陳介南

（1.羅甸縣林業(yè)局，貴州 羅甸 550100；2. 國家林業(yè)局 生物乙醇研究中心，湖南 長沙 410004；3. 中南林業(yè)科技大學(xué) 生物環(huán)境科學(xué)與技術(shù)研究所，湖南 長沙 410004）

羅甸縣不同種源麻風(fēng)樹抗寒生理生態(tài)學(xué)研究

歐國騰1，詹 鵬2,3，江 贏1，石 旺2,3，陳介南2,3

（1.羅甸縣林業(yè)局，貴州 羅甸 550100；2. 國家林業(yè)局 生物乙醇研究中心，湖南 長沙 410004；3. 中南林業(yè)科技大學(xué) 生物環(huán)境科學(xué)與技術(shù)研究所，湖南 長沙 410004）

通過對貴州省羅甸縣2011年初不同種源麻風(fēng)樹凍害情況的調(diào)查與分析，并通過植株內(nèi)源保護(hù)酶活性及遺傳基因圖譜分析，研究麻風(fēng)樹抗寒生理生態(tài)學(xué)特性。結(jié)果表明：隨著海拔的升高，麻風(fēng)樹凍害程度逐步加重;羅甸縣高里村與紅水河鎮(zhèn)麻風(fēng)樹具有較強(qiáng)的親緣關(guān)系;雖然羅甸林場麻風(fēng)樹與高里村、紅水河鎮(zhèn)麻風(fēng)樹的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但其抗寒基因表達(dá)較強(qiáng)。綜合分析得出，不同種源麻風(fēng)樹抗寒能力為高里村＞林場＞紅水河鎮(zhèn)＞納翁村。

麻風(fēng)樹；抗寒；生理生態(tài)學(xué)；羅甸

麻風(fēng)樹Jatropha curcas是大戟科麻風(fēng)樹屬Jatropha的植物，廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，在我國的云南、四川、貴州、廣東等都有分布，可在年降水量480～2 380 mm、年氣溫18.0～28.5℃、海拔1 000 m以下的環(huán)境下生存[1]。麻風(fēng)樹生長繁殖快，耐貧瘠干旱，是綠化荒山、水土保持的良好樹種；其種仁含油率高達(dá)50%～60%，是世界范圍內(nèi)研制生物柴油的熱門植物[2-3]。低溫是阻礙麻風(fēng)樹生長和分布的重要環(huán)境因子，也是制約麻風(fēng)樹制取生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。研究麻風(fēng)樹的抗寒生態(tài)學(xué)性質(zhì)，有助于了解麻風(fēng)樹的生長習(xí)性，對抗寒抗凍優(yōu)質(zhì)樹種引種栽培、提高麻風(fēng)樹的種植規(guī)模、保障生物柴油原料資源的大規(guī)模供應(yīng)具有重要意義。

目前國內(nèi)對麻風(fēng)樹低溫抗寒抗凍性研究已有少量報道。羅通等[4]從葉綠素含量、根系活力、生物膜通透性、膜脂不飽和脂肪酸含量等方面進(jìn)行了低溫對麻風(fēng)樹生理指標(biāo)的影響研究。毛俊娟等[5]以攀枝花地區(qū)麻風(fēng)樹為材料，研究不同濃度酸鋁脅迫對3月齡麻風(fēng)樹幼苗根系活力、葉片丙二醛含量、葉片脯氨酸含量、過氧化物酶活性等生理指標(biāo)的影響。樊哲仁等[6]通過測定種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、丙二醛含量和酶活性等指標(biāo)，調(diào)查硅對鹽脅迫下麻風(fēng)樹的生理影響。丁蕾等[7]對不同種源麻風(fēng)樹進(jìn)行播種育苗試驗，通過測試苗高、地徑生長，對比分析得出不同種源的抗寒性有較大差異。已有報道中絕大多數(shù)僅進(jìn)行低溫與麻風(fēng)樹生理生化指標(biāo)關(guān)系研究，未從麻風(fēng)樹種源的基因水平分析低溫與麻風(fēng)樹抗寒特性的生態(tài)學(xué)關(guān)系，缺乏麻風(fēng)樹遺傳基因水平上對抗寒性的認(rèn)知。

2011年初我國南方遭遇特大凍雨、雪凝災(zāi)害，且范圍廣，降溫幅度大，持續(xù)時間長，給麻風(fēng)樹帶來了極其嚴(yán)重的凍害現(xiàn)象，大量麻風(fēng)樹凍傷或凍死。本文中通過對貴州省羅甸縣不同種源麻風(fēng)樹凍害情況的調(diào)查與分析，并通過植株內(nèi)源保護(hù)酶活性（超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶）及遺傳基因圖譜分析，獲得麻風(fēng)樹抗寒生態(tài)學(xué)特性，以期為篩選出抗凍害優(yōu)質(zhì)麻風(fēng)樹資源及麻風(fēng)樹的引種栽培提供借鑒。

1 研究區(qū)域自然概況

羅甸縣位于貴州南部邊緣，地處106°23′～107°03′E、25°04′～ 25°45′N，總面積 3 013 km2，是云貴高原向桂西北山區(qū)與丘陵過渡的斜坡地帶，地勢北高南低，呈階梯式下降。境內(nèi)屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，具有春早、夏長、秋遲、冬短的特點，日照為1 350～1 520 h，年平均溫度達(dá)20℃，極端最高氣溫40.5℃，極端最低氣溫零下3.5℃，年均降水量為1 335 mm，無霜期335 d左右，氣候溫和，雨量充沛，資源豐富，有“天然溫室”之稱。抽樣調(diào)查地點設(shè)在羅甸縣沫陽鎮(zhèn)林勒村和那翁村及茂井鄉(xiāng)的高里村，海拔高度500～900 m，土壤類型為黃壤、砂壤和風(fēng)化石礫土3種。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

在羅甸縣1年生麻風(fēng)樹人工林隨機(jī)選取1 m×1 m的樣地，并將植株全部挖起，逐株查看其凍害情況，調(diào)查其莖、根的凍害情況（見圖1）。同時采取不同種源的麻風(fēng)樹葉，并放入液氮罐中固定，帶回實驗室用于分析測定。

2.2 實驗方法

2.2.1 凍害程度調(diào)查

① 凍害植株百分率：表現(xiàn)有凍害的植株占調(diào)查植株總數(shù)的百分?jǐn)?shù)；② 凍害指數(shù)：對調(diào)查的麻風(fēng)樹植株逐株確定其凍害程度，凍害程度分為：0級，植株正常，莖和根沒受凍害；1級，莖尖凍傷，側(cè)根及主根沒受凍害；2級，枝條凍傷，根部輕微凍害，側(cè)根受凍變色，主根沒受凍害；3級，枝條大部受凍，根部中度凍害，主根根尖及側(cè)根受凍變色；4級，全株受凍，根部重度凍害，主根凍死并脫皮變色，植株死亡。分株調(diào)查后，按公式（1）計算凍害指數(shù)（I）[8]：

圖1 羅甸縣不同種源麻風(fēng)樹樣地分布Fig. 1 Distribution of different provenances J. curcas sample plots in Luodian County

式（1）中：I為凍害指數(shù)；m為調(diào)查總株數(shù)；S1、S2、S3、S4為各樣地中表現(xiàn)為1～4級凍害的麻風(fēng)樹株數(shù)。

2.2.2 抗氧化酶活力

酶液的提取采用改進(jìn)的趙梅等[9]的方法：從液氮罐中取出待測樣品2 g于預(yù)冷研缽中，加入酶提取（磷酸緩沖液，pH值為7.8），冰浴上研磨成勻漿，4℃下12 000 r/min離心20 min，取上清液用于抗氧化酶活力的測定。

超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法[10]，以每克植物鮮質(zhì)量抑制NBT光化還原量為酶活單位；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法[11]，以每克植物鮮質(zhì)量每分鐘氧化 1 μmol愈創(chuàng)木酚為一個酶活單位；過氧化氫酶（CAT）活性采用H2O2-碘量法[12]，以每克植物鮮質(zhì)量每分鐘分解 1 μmol H2O2為1個酶活單位。

2.2.3 RAPD-PCR

麻風(fēng)樹DNA提取方法參考李靜等[13]的CTAB法，RAPD-PCR方法采用Ganesh等[14]的方法，所用RAPD-PCR引物如表1所示。

表1 引物序列Table 1 RAPD random primer sequences

3 結(jié)果與分析

3.1 調(diào)查結(jié)果

2010年12月25日至2011年2月22日，羅甸縣經(jīng)歷了持續(xù)長時間的低溫冰凍天氣（見圖2），尤其是1月日平均氣溫5.8 ℃，日平均最高溫8.4℃，日平均最低溫4.0 ℃，月最高溫13.2 ℃，月最低溫0.6 ℃。2010年12月25日至2011年2月22日，日均氣溫10 ℃以下天數(shù)41 d，低溫持續(xù)時間長，為羅甸縣麻風(fēng)樹帶來毀滅性破壞。

圖2 2011年初羅甸縣氣溫變化曲線Fig.2 Change curves of temperature in Luodian countyin early 2011

如表2所示，海拔500 m以上植株全部受凍，受凍率為100%，凍害指數(shù)25～100；海拔500～550 m的麻風(fēng)樹凍害多為1～3級，凍害指數(shù)25～71.6；在海拔550 m以上，1年生實生苗凍害多為2～3級，凍害指數(shù)為67。海拔500～555 m處麻風(fēng)樹受凍部位主要在地上部的枝條末端及地下部的側(cè)根；海拔＞555 m處麻風(fēng)樹表現(xiàn)為全株凍死。枝條末端凍傷癥狀為植物組織顏色變黑、失水干枯、表皮皺縮，部分粗枝和主干似被開水燙過呈不規(guī)則水漬狀的凍斑。整株凍死麻風(fēng)樹的根表現(xiàn)為表皮開裂易脫落且大面積變黑或呈深褐色，深達(dá)木質(zhì)部，并有很濃的酒糟味。通過表2綜合比較，不同種源麻風(fēng)樹抗凍性由強(qiáng)至弱為高里村＞林場＞紅水河鎮(zhèn)＞納翁村。

表2 不同海拔麻風(fēng)樹的凍害情況Table 2 Frozen injury of J. curcas at different altitudes

3.2 葉片抗氧化酶活力

植物的抗寒性與活性氧代謝關(guān)系密切，低溫脅迫下植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的H2O2、OH-等活性氧自由基，可導(dǎo)致膜脂過氧化，進(jìn)而造成膜系統(tǒng)的氧化損傷。為了避免這種氧化損傷，植物體內(nèi)也存在著一系列酶促的和非酶促的抗氧化劑、活性氧自由基，保護(hù)植物細(xì)胞免受活性氧的傷害，維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，以增強(qiáng)植株的抗寒力。

圖3 不同種源麻風(fēng)樹的酶活性Fig.3 Enzyme activity of different provenances J. curcas

如圖3所示，對SOD酶，納翁村（581 μ·g-1）＞紅水河鎮(zhèn)（563 μ·g-1）＞林場（526 μ·g-1）＞高里村（394 μ·g-1）；對POD酶，高里村（7 348 μ·g-1min-2）＞林場（5 319 μ·g-1min-2）＞紅水河鎮(zhèn)（5 026 μ·g-1min-2）＞納翁村（4 897 μ·g-1min-2）；對CAT酶，紅水河鎮(zhèn)（694 μ·g-1min-1）＞高里村（687 μ·g-1min-1）＞納翁村（675 μ·g-1min-1）＞林場（326 μ·g-1min-1）。不同種源地麻風(fēng)樹的抗氧化酶存在差異性。

SOD、POD、CAT是清除活性氧過程中最主要的抗氧化酶類。SOD能及時清除活性氧和自由基，其活性的大小與植物體的抗性是密切相關(guān)的。POD酶促降解植物體內(nèi)積累的H2O2，避免因H2O2的過量積累導(dǎo)致毒性更大的OH-含量增加而對細(xì)胞膜產(chǎn)生傷害。CAT能消除細(xì)胞內(nèi)過多的H2O2，維持其在一個低水平，從而保護(hù)膜的結(jié)構(gòu)。李遠(yuǎn)發(fā)等[7]對麻風(fēng)樹抗寒性研究報道，發(fā)現(xiàn)POD酶活與抗寒性具有顯著的正相關(guān)性，SOD酶活與抗寒性呈一定的負(fù)相關(guān)性，SOD、CAT酶活與抗寒性的關(guān)系不顯著。通過分析3種酶活性可得，不同種源麻風(fēng)樹抗寒性強(qiáng)弱為：高里村＞林場＞紅水河鎮(zhèn)＞納翁村，與麻風(fēng)樹抗寒性調(diào)查結(jié)果一致。

3.3 不同種源麻風(fēng)樹親緣關(guān)系研究

所提取麻風(fēng)樹DNA 樣本的色澤為白色或近白色，采用核酸和蛋白質(zhì)含量測定儀（Gene Quant Pro）檢測 260、280 nm 波長處的光吸收比值 OD260/OD280為 1.875， 計算得 DNA 產(chǎn)率為 0.346 μg/L。如圖4所示，各樣地麻風(fēng)樹樣本基因組 DNA 電泳得到的條帶可進(jìn)行后續(xù)RAPD-PCR分析。

圖4 麻風(fēng)樹總DNA電泳圖Fig.4 DNA electropherogram of different provenances J. curcas

由圖5可知，各樣本均擴(kuò)增出3～4個條帶。綜合對比1～4號樣本，各樣本的特異性條帶不明顯；1、4號樣有3個條帶，2、3號樣有4個條帶。通過DPS軟件進(jìn)行WPGMA聚類分析（見圖6）可得，高里村、紅水河鎮(zhèn)麻風(fēng)樹親緣性較近；林場麻風(fēng)樹與高里村、紅水河鎮(zhèn)麻風(fēng)樹具有較遠(yuǎn)的親緣性關(guān)系；納翁村麻風(fēng)樹與高里村、紅水河鎮(zhèn)麻風(fēng)樹也具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。在麻風(fēng)樹種源地緣上，林場種源來自于云南省紅河州，高里村、紅水河鎮(zhèn)、納翁村麻風(fēng)樹均為羅甸縣本地種源。然而，對比抗寒性調(diào)查及抗氧化酶活實驗結(jié)果，林場麻風(fēng)樹抗寒性僅次于高里村麻風(fēng)樹，可能的原因是雖然擴(kuò)增出的DNA多態(tài)性不強(qiáng)，但麻風(fēng)樹抗寒基因的表達(dá)較強(qiáng)。各種源地麻風(fēng)樹抗寒基因的表達(dá)需要做進(jìn)一步的研究。

圖5 不同種源麻風(fēng)樹RAPD電泳圖Fig. 5 RAPD amplif i cation results of different provenances J. curcas

圖6 WPGMA聚類圖Fig.6 WPGMA cluster analysis

4 結(jié) 論

通過實地調(diào)查、分析測試羅甸縣不同種源麻風(fēng)樹內(nèi)源保護(hù)酶及遺傳基因圖譜，獲得羅甸縣境內(nèi)麻風(fēng)樹造林宜在海拔550 m以下。高里村與紅水河鎮(zhèn)麻風(fēng)樹具有較強(qiáng)的親緣關(guān)系。雖然林場麻風(fēng)樹與高里村、紅水河鎮(zhèn)麻風(fēng)樹的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但因其抗寒基因表達(dá)較強(qiáng)，抗寒能力較好，可以作為抗寒性優(yōu)質(zhì)種源。羅甸縣不同種源麻風(fēng)樹抗寒能力強(qiáng)弱為高里村＞林場＞紅水河鎮(zhèn)＞納翁村，綜合考慮可選高里村和林場麻風(fēng)樹為抗寒性優(yōu)質(zhì)種源。

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Physioecology study on cold resistance of different provenances Jatropha curcas in Luodian county

OU Guo-teng1, ZHAN Peng2,3, JIANG Ying1, SHI Wang2,3, CHEN Jie-nan2,3
(1. Luodian County Bureau of Forestry, Luodian 550100, Guizhou, China; 2. Bio-ethanol Research Center of Forestry Ministry,Changsha 410004, Hunan, China; 3. Institute of Biological and Environmental Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

Through investigating the frozen injury of different provenancesJatropha curcasduring early 2011 in Luodian, Guizhou, and analyzing endogenous protection enzyme activities and genetic spectrums, the physioecology of cold resistance of theJ. curcaswere studied. The results show that the frozen injury degree increased gradually with the increase of altitude; A strong genetic relationship ofJatropha curcasexisted between the ones in Gaoli Village and in Red water Town; Though, there was a distant genetic relationship ofJatropha curcasbetween the ones in Luodian Forest Farm and Gaoli Village, the cold resistance gene expressed strongly. The order of cold tolerance of differentJatropha curcaswas Gaoli Village＞ Luodian Forest Farm ＞ Red water Town ＞ Naweng Village.

Jatropha curcas; cold resistance; physioecology; Luodian county

S722.3+3

A

1673-923X(2013)01-0011-04

2012-10-15

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項項目（200904038）；國家林業(yè)局麻瘋樹種質(zhì)資源保存庫項目

歐國騰（1974-），男，貴州黎平人，高級工程師，主要從事林業(yè)監(jiān)測、防治工作

陳介南（1961-），男，湖南益陽人，教授，博士，主要從事林業(yè)生物質(zhì)能源研究；E-mai:chenjny@gmail.com

[本文編校：謝榮秀]