超聲提取白刺中總生物堿及大孔樹脂純化的工藝研究

王玉玲，曾會明，張建秋，馬挺軍

（1.北京林業(yè)大學，北京 100083；2.白城市林業(yè)科學院，吉林 白城 137000；3. 北京農學院 食品科學學院，北京 102206）

超聲提取白刺中總生物堿及大孔樹脂純化的工藝研究

王玉玲1，曾會明1，張建秋2，馬挺軍3

（1.北京林業(yè)大學，北京 100083；2.白城市林業(yè)科學院，吉林 白城 137000；3. 北京農學院 食品科學學院，北京 102206）

為優(yōu)化西伯利亞白刺種籽中總生物堿的提取工藝，采用超聲波提取總堿，以硫酸阿托品為對照品，酸性染料比色法測定白刺中總生物堿的含量，探討料液比、提取溫度、時間、乙醇濃度4個因素的影響，確定最佳提取參數。從7種大孔吸附樹脂中篩選出對白刺生物堿有最佳分離純化效果的一種樹脂，研究其對生物堿靜態(tài)、動態(tài)吸附、解析效果。研究結果表明，當料液比為1:20，溫度60℃，時間40 min，乙醇濃度70%時，總生物堿提取率(生物堿/種籽重)最高，217.372 9 μg/g；D101對白刺總生物堿的吸附、解析效果最好，對其進行動態(tài)吸附，可知最佳的工藝條件為上樣液pH值為5，流速為0.75 mL/min，乙醇的洗脫濃度為80%。

西伯利亞白刺；超聲波；生物堿；大孔樹脂

白刺屬植物是蒺藜科下的一個古老小屬，為多分枝的耐鹽喜潛水的旱生落葉小灌木，根據化石花粉研究屬第三紀孑遺植物，是中亞大陸荒漠地帶的典型植被。白刺果實在民間被用于治療脾胃虛弱、神經衰弱、消化不良、感冒等癥狀[1]，經研究發(fā)現唐古特白刺果具有調解血糖、血脂, 降血壓,提高人體免疫力,抗疲勞、抗寒冷,增進睡眠程度等功效[2]，其葉則作為民間藥，用于治療痙攣、神經痛和心律不齊等癥[3]。有研究文獻記載白刺

中含有卡波林類生物堿等多種化學成分[4-6]，其地上部分含有的生物堿經動物試驗表明對麻醉犬和麻醉貓具有降低血壓的作用[7]。在利用白刺果實的時候，能產生大量的白刺種籽，目前已開展了多種關于白刺育苗的實驗研究，如播種量、覆土厚度、施肥量等[8]，但對白刺種籽其他方面的研究卻少之又少，因此本文采用超聲波法提取西伯利亞白刺種籽中的生物堿，酸性染料比色法測定其中總生物堿的含量。

大孔樹脂吸附技術是20世紀70年代發(fā)展起來的一種新工藝，是將中草藥提取液通過大孔樹脂，吸附其中的有效成分，再經洗脫回收，除掉雜質的一種純化精制方法[9-11]。將其應用于分離純化，具有物理化學選擇性好，比表面積大，穩(wěn)定性高，吸附速度快，解吸條件溫和，再生處理方便，使用周期長，宜于構成閉路循環(huán)、節(jié)省費用等優(yōu)點[12-13]，本文從7種大孔樹脂中篩選出適合白刺總生物堿分離純化的類型，并確定最佳工藝條件，為進一步開發(fā)利用白刺提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

原料： 西伯利亞白刺種籽由吉林省白城市林科院提供，在105 ℃的干燥箱中烘烤2 h后粉碎，過60目篩，備用。

主要試劑： 硫酸阿托品，購自中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、無水碳酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純，購自北京化工廠；水為超純水。

主要設備： KQ-500DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)儀RE-200B，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，上海知信實驗儀器技術有限公司；臺式低速離心機（TW5A-WS），長沙湘儀離心機儀器有限公司；橫流泵（HL-2），上海嘉鵬科技有限公司；紫外-可見分光光度計（TU-1810），北京普析通用儀器有限公司；pH計，上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 西伯利亞白刺中總生物堿含量的測定

（1）溴甲酚綠的制備 精密稱取溴甲酚綠0.125 g于250 mL三角瓶中, 用0.2 mol/L的氫氧化鈉溶解，加入領苯二甲酸氫鉀2.55 g， 加水至接近250 mL，用2%的鹽酸調pH值至4.42，定容至250 mL。

（2）標準曲線的繪制 精密稱取硫酸阿托品0.025 g，置于小燒杯中，加水溶解后轉移至25 mL的容量瓶中，定容至刻度，量取5 mL置于100 mL容量瓶中，定容至刻度，即得50.0 μg/mL的對照品溶液。

分別取上述溶液0、1、2、3、4、5 mL于10 mL的試管中，各加氯仿定容至6 mL，分別加4 mL溴甲酚綠溶液，轉移至分液漏斗中，加15 mL氯仿，震蕩3 min,靜置30 min,使水層和氯仿層分清后，取氯仿層至25 mL容量瓶中，定容。以第一份為空白，第二份在300～500 nm內光譜掃描，得知在415.5 nm處有最大吸收值，因此選415.5為含量測定的最大波長。以第一份為空白，在415.5 nm處測吸光值，繪制標準曲線。

（3）白刺總生物堿的提取及含量的測定 取西伯利亞白刺粉末5 g，加入一定量的乙醇超聲處理，離心，取濾液，旋轉蒸發(fā)濃縮得糖漿狀，用2%的HCL溶解，合并酸水液，過濾，濾液以5%的碳酸鈉堿化至pH值 9～10，用氯仿（每次20 mL）萃取3次，合并氯仿液，旋轉蒸發(fā)濃縮，將濃縮液定容至5 mL，取1 mL于10 mL的試管中，用氯仿補足6 mL，加4 mL溴甲酚綠溶液，轉移至分液漏斗中，加15 mL氯仿，震蕩3 min，靜置30 min，使水層和氯仿層分清后，取氯仿層至25 mL容量瓶中，定容，在415.5 nm處測吸光度。然后根據標準曲線，找出所得吸光值對應的生物堿濃度，進而計算總生物堿的含量。

1.2.2 提取工藝的優(yōu)化

(1) 單因素實驗 準確稱取白刺粉末5g，分別考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）、提取溫度（30、40、50、60、70℃）、提取時間（20、30、40、50、60 min）、乙醇濃度（50、60、70、80、90、100%）對白刺生物堿提取率的影響。

(2) 正交實驗 通過單因素實驗，得到影響白刺生物堿的單因素的最佳提取條件，在此基礎上，采用四因素三水平的L9(34)正交實驗做進一步的優(yōu)化，具體的因素水平見表1：

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental design

1.2.3 大孔樹脂型號的篩選

供試品溶液的配制 取白刺粉末10 g，在上述確定的最佳工藝條件下超聲提取后，離心，取濾液，旋轉蒸發(fā)濃縮得糖漿狀，用2%的HCL溶解，合并酸水液，過濾，定容至100 mL，作為供試液。取1 mL上述提取液于10 mL的磨口試管中，按1.2.1步驟在415.5 nm處測吸光度，計算提取液中總生物堿的濃度。

靜態(tài)吸附 準確稱取各種型號的濕樹脂2 g，分別裝入100 mL的三角瓶中，加入20 mL的上述供試液，將三角瓶放入搖床中，在90 次/min的震速下震蕩吸附24 h，將吸附后的白刺提取液真空抽濾，濾液按1.2.1步驟在415.5 nm處測吸光度。將抽濾后的濕樹脂倒回三角瓶中，加入40 ml 95%乙醇，震蕩解吸24 h，解吸后的樣品真空抽濾，將乙醇旋轉蒸發(fā)后，用20 ml 2%的HCL溶解，然后按1.2.1步驟在415.5 nm處測吸光度。

各種樹脂的吸附率和解析率按以下公式計算：

式（1）～（2）中：k吸為吸附率，k吸初為吸附液初濃度；k吸后為吸附后溶液的濃度；k解為解析率；k解后為解吸后溶液濃度。

1.2.4 均勻設計純化生物堿的工藝研究

根據上述靜態(tài)吸附帥選出的樹脂類型，及考慮白刺生物堿的化學結構和性質，試驗選擇D101型大孔樹脂進行分離、純化生物堿。影響白刺生物堿提取純化效果的因素主要有上柱樣品液的pH值、流速、洗脫液（乙醇）濃度等，故選擇上述三個因素進行考察，每個因素選5個水平進行均勻設計試驗，以總生物堿的保留率為指標，優(yōu)選出最佳的純化工藝條件，因素水平表如下：

表2 均勻設計試驗因素水平Table 2 Factors and levels of uniform design

將樹脂用蒸餾水沖洗，使其充分溶脹，然后倒入一定的蒸餾水，抽真空，取處理好的樹脂濕法裝柱，將上柱樣品液用1 mol/L的HCL和1 mol/L的NaOH調至預定的pH值（以pH值計精準測定），精密量取60 ml的樣品液上柱，并按因素水平表設定流速，先以清水洗脫雜質，再用預定濃度的乙醇洗脫，最后收集洗脫液，按1.2.1方法測定其中生物堿的含量。

2 結果和分析

2.1 繪制標準曲線

按1.2.1方法，以測得的吸光度為縱坐標，硫酸阿托品含量為橫坐標，作標準曲線(如下圖)，計算得回歸方程為y=0.047 2x-0.011 0,R2=0.999 3，表明硫酸阿托品溶液濃度在2.0～10.0 ug/ml時，濃度與吸光度線性關系良好。

圖1 濃度與吸光度的標準曲線Fig.1 Standard curve of concentration and absorbance

2.2 單因素實驗

2.2.1 不同料液比對總生物堿提取效果的影響

由圖1可知，白刺總生物堿的提取量隨料液比的增大而先增大后減少，在1∶20時達到最大，這可能是因為隨料液比的增大，細胞內外的濃度差越大，內擴散的速率也就越大，越有利于生物堿的溶出，所以開始時生物堿的提取量是增大的，但當溶劑太多時，超聲波輻射被溶劑大量吸收，而不能完全作用于物料，從而影響生物堿的提取量，且料液比太大也會浪費溶劑的使用，因為正交試驗選取1∶15、1∶20、1∶25較為合適。

圖2 料液比對總生物堿含量的影響Fig. 2 Effects of ratios of solvent to material on yield of total alkaloids

2.2.2 不同提取溫度對總生物堿提取效果的影響

由圖2可知，隨著溫度的提高，白刺總生物堿的提取量也不斷升高，但到70℃時升高的幅度不大，可能是溫度太高會使生物堿的結構不穩(wěn)定，發(fā)生分解，另外，溫度太高，乙醇揮發(fā)也會要嚴重，也會影響生物堿的提取，從工廠的實際生產來來考慮，做正交試驗時選取40、50、60℃為宜。

2.2.3 不同提取時間對總生物堿提取效果的影響

圖3 溫度對總生物堿含量的影響Fig. 3 Effect of temperature on yield of total alkaloids

由圖3可知，隨著超聲時間的延長，白刺總生物堿的提取量先增加后減少，在50 min時達到最大，可能是隨著時間增長，可溶性成分溶出的就越多，使得提取粘液度增大，另外時間太久也會使生物堿的結構遭到破壞，時間太少，提取的生物堿含量又太少，因此選40、50、60 min做正交試驗。

圖4 時間對總生物堿含量的影響Fig 4 Effect of time on yield of total alkaloids

2.2.4 不同乙醇濃度對總生物堿提取效果的影響

由圖4可知，隨乙醇濃度的增加，提取生物堿的含量是先增加后減少，在70%處達到最大，其原因可能與白刺中所含生物堿的種類及極性有關，正交試驗時選60%、70%、80%為宜。

圖5 乙醇濃度對總生物堿含量的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on yield of total alkaloids

2.3 正交實驗

通過表3的正交試驗結果可知，確定西伯利亞白刺種籽生物堿超聲提取的最佳工藝組合為A2B3C1D2，即料液比為1∶20，溫度60℃，時間為40 min，乙醇濃度70%，每克白刺粉末中含總生物堿的量為217.372 9 ug，李方群，劉金榮等[14]曾測得西伯利亞白刺葉子中總生物堿平均含量為0.57%，成熟果實中0.022%（即220 μg/g），未成熟果實中0.004%，本文中所測得的生物堿含量與其成熟果實中近似，這說明成熟果實中的生物堿主要分布在種籽內；由方差分析可知，超聲提取白刺生物堿各因素的影響順序為D＞C＞A＞B，即乙醇濃度＞時間＞料液比＞溫度，乙醇濃度影響尤為重要，由此說明超聲提取白刺總生物堿時對乙醇濃度最為敏感，對其他因素敏感度較小。

表3 正交實驗結果Table 3 Results of orthogonal experiments

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

2.4 靜態(tài)吸附

通過7種大孔樹脂對生物堿的靜態(tài)吸附實驗，根據所提供的公式進行計算，得到的各種型號樹脂的吸附率及解析率如表4，可看出D101型號的樹脂對生物堿的吸附率及解析率都是最高的，說明D101型號的大孔樹脂相對其他幾種樹脂是最適合白刺的生物堿分離純化的。

表5 不同型號樹脂篩選結果Table 5 Screening results of different types of resin

2.5動態(tài)吸附

式（3）中：k保為保留率；k1為樣品洗脫后總生物堿含量；k2為白刺中總生物堿的含量。

從表6可以看出，以生物堿保留率為考察指標，1號實驗所得保留率最高，此時的工藝條件為上樣液pH值為5，流速為0.75 mL/min，乙醇的洗脫濃度為80%。

表6 均勻設計實驗結果Table 6 Experimental results of uniform design

3 討 論

超聲波提取西伯利亞白刺種籽中總生物堿時各因素對總生物堿提取量的影響次序是乙醇濃度＞時間＞料液比＞溫度。最佳的提取工藝為料液比為1∶20，溫度60℃，時間40 min，乙醇濃度70%。在此條件下提取白刺種籽中總生物堿的含量為 217.372 9 μg/g。

通過7種大孔樹脂對生物堿的靜態(tài)吸附及解析實驗，得出D101對白刺總生物堿的吸附、解析效果最好，對其進行動態(tài)吸附，可知最佳的工藝條件為上樣液pH值為5，流速為0.75 mL/min，乙醇的洗脫濃度為80%。

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Ultrasound extraction total alkaloids from Nitraria sibirica Pall and process research of macroporous resin purif i cation

WANG Yu-ling1, ZENG Hui-ming1, ZHANG Jian-qiu2, MA Ting-jun3
(1. Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2. Baicheng City Academy of Forestry, Baicheng 137000, Jilin, China; 3. College of Food Science, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)

In order to optimize the extract condition, total alkaloids inNitraria sibiricawas extracted by ultrasound and the content of total alkaloids was determined by the acidic dye colorimetry, the effects of solid-liquid ratio, temperature, time and ethanol concentration on the optimum extraction parameters were investigated, thereby determining the optimal extraction parameters; the best one of isolation and purif i cation from seven kinds of resin were screened out to research its effects on the alkaloids of static, dynamic adsorption. The results show that with the conditions of solid-liquid ratio of 1:20, temperature 60 ℃, time 40 minutes, ethanol concentration of 70%, the highest total alkaloid extract rate was 217.372 9 μg/g; the adsorption and resolution effects of D101 onN. sibirica’s total alkaloids were the best, the dynamic adsorption tests proved that the optimum process conditions were: sample solution pH 5, fl ow rate 0.75mL/min,ethanol concentration 80%.

Nitraria sibiricaPall; ultrasound; alkaloid; macroporous resin

S789.3；S723.1

A

1673-923X(2013)01-0109-05

2012-10-10

863課題（2009VV10Z109）；北京市農產品加工及貯藏工程重點建設學科（PXM2009_014207_078172)

王玉玲（1987-），女，碩士研究生，從事植物資源的開發(fā)利用；E-mail:wangyuling64@163.com

曾會明，男，副教授，從事草坪草育種；E-mail:sciinfo@163.com

[本文編校：歐陽欽]