慢性應(yīng)激抑郁型黃褐斑動物模型建立與現(xiàn)有模型的比較研究

[摘要]目的：建立并驗(yàn)證慢性應(yīng)激抑郁型黃褐斑動物模型， 并與現(xiàn)有其他模型進(jìn)行比較。方法：在注射黃體酮同時(shí)， 進(jìn)行慢性輕度不可預(yù)見的應(yīng)激刺激，并紫外線局部照射。結(jié)果：黃體酮+紫外線+慢性應(yīng)激抑郁法造模較其他方法更能導(dǎo)致皮膚丙二醛（Malondialdehyde，MDA）升高和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）降低以及皮膚黑素細(xì)胞的增加， 并且具有抑郁癥的行動學(xué)表現(xiàn)。與空白組比較， 經(jīng)慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激刺激的動物體重顯著下降，敞箱試驗(yàn)中穿格次數(shù)、理毛時(shí)間和次數(shù)、直立次數(shù)得分顯著下降，液體消耗試驗(yàn)中糖水消耗和糖水偏愛百分比明顯下降， 而純水消耗顯著提高。結(jié)論：黃體酮+紫外線+慢性應(yīng)激抑郁法建立的抑郁型黃褐斑豚鼠多因素模型獲得成功。與現(xiàn)有其他模型比較，其皮膚MDA、SOD與皮膚黑素細(xì)胞等客觀指標(biāo)的變化也更加接近人類黃褐斑的病變。

[關(guān)鍵詞]黃褐斑；抑郁癥；動物模型

[中圖分類號]R758.4+2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）03-0349-06

黃褐斑是臨床的常見病之一， 近年來國內(nèi)外學(xué)者嘗試運(yùn)用激光[1]和強(qiáng)脈沖光治療黃褐斑取得了一些進(jìn)展，為黃褐斑的治療來了新的契機(jī)[2-3]。但激光照射對人表皮黑素細(xì)胞生物學(xué)的影響卻并不十分清楚?；A(chǔ)研究顯得尤為重要，使得黃褐斑的動物模型的研究成為非常重要的課題。查閱以往關(guān)于黃褐斑的動物模型研究文獻(xiàn)，國內(nèi)外均有報(bào)道，主要以小鼠局部紫外光照射[4-5]、內(nèi)用雌激素全身攻擊[6]、微量定點(diǎn)注射輔以紫外線照射[7]等方法進(jìn)行造模，由于黃褐斑是多因素致病機(jī)理而產(chǎn)生，單一因素造模法建立的動物模型代表性比較差。綜合其諸多因素的考慮，筆者通過紫外線照射、雌激素全身攻擊、慢性輕度不可預(yù)見的應(yīng)激刺激建立黃褐斑實(shí)驗(yàn)動物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物：健康純白色雌性豚鼠60只，清潔級，體質(zhì)量（280±12）g，隨機(jī)分為5組，每組12只，由深圳市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑：黃體酮注射液1ml：20mg（上海通用藥業(yè)股份有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、酪氨酸（Tyr）檢測試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；HMB45 （melanoma 黑素瘤） 鼠抗人單克隆抗體即用型試劑盒（福建邁新公司）；中性樹膠（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)器材：紫外線照射燈（UVB，德國Waldmann）；UV2401PC紫外分光光度計(jì)（日本島津公司） ；CMIAS多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)2000型 （空軍總醫(yī)院與北京航空航天大學(xué)共同研制）。

1.2 動物造模方法：造模時(shí)間28天。①空白組：以10% NaS2 水溶液背部脫毛， 每周脫毛一次，背部裸露約2.0cm×2.0cm面積皮膚1塊；每天肌肉注射注射用水，5ml/kg體質(zhì)量；②紫外線組[4]：同正常組脫毛處理，每日以波長為320nm 的中波紫外線（UVB）照射豚鼠背部皮膚1次，照射時(shí)間30min，動物與光源的距離為20cm；③黃體酮組[6]：同正常組脫毛處理，每日8：00～9：00交替于豚鼠兩后腿肌肉注射0.4%黃體酮， 5ml/kg體質(zhì)量；④紫外線+黃體酮組：同正常組脫毛處理，紫外線照射方法和黃體酮注射方法同紫外線組和黃體酮組；⑤紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組：同正常組脫毛處理，紫外線照射方法和黃體酮注射方法同紫外線組和黃體酮組。同時(shí)進(jìn)行慢性輕度不可預(yù)見性的應(yīng)激抑郁豚鼠模型方案： 按照文獻(xiàn)[8-9]并略加改進(jìn)， 將明暗顛倒24h、2h行為限制、停食24h、停水24h、夾尾1 min、40 ℃水中游泳5min、電擊足底5s（30 伏電壓）、搖晃5min （160HZ）、40℃環(huán)境5 min共9種刺激隨機(jī)安排到28日內(nèi)，每日1 種， 每種刺激出現(xiàn)2 次，使動物不能預(yù)料刺激的發(fā)生，同種刺激不能重復(fù)出現(xiàn)。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 皮膚黑素細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)觀察：取豚鼠明顯的色變?nèi)ッつw1塊（0.2cm×0.2cm） ，10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片。再經(jīng)脫蠟至水化、抗原修復(fù)后，用HMB45 （melanoma 黑素瘤） 為第一抗體，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用PBS代替一抗做陰性對照。

1.3.2 顯微鏡圖像分析[10]：采用病理圖像分析系統(tǒng)對目標(biāo)圖像進(jìn)行定量分析，隨機(jī)選擇每張切片在顯微鏡物鏡400X下5個(gè)不重疊視野進(jìn)行彩色圖像采集與存儲，計(jì)算出每個(gè)視野中的目標(biāo)個(gè)數(shù)、陽性目標(biāo)面積、平均灰度值與平均光密度值等。

1.3.3 MDA、SOD及酪氨酸活性測定：切取脫毛部位皮膚0.2g ，用預(yù)冷生理鹽水（4℃） 沖洗，除盡雜質(zhì)，拭干，分別放入有2.0ml 預(yù)冷生理鹽水的小試管內(nèi)，用細(xì)胞粉碎機(jī)勻漿4次，每次5s。勻漿后以3500 r/min 離心15 min，取上清液采用試劑盒檢測MDA、SOD及酪氨酸活性。

1.4 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 敞箱試驗(yàn)[11]：敞箱裝置由不透明材料制成， 底面為76cm×76cm的正方形并被等分為25 個(gè)等邊方格， 周圍有高42cm的圍墻。于第29天7：30～12：00 之間在安靜的房間內(nèi)進(jìn)行此項(xiàng)試驗(yàn)觀察。將豚鼠置于中心方格內(nèi)，觀察豚鼠在5min內(nèi)中央格停留時(shí)間、穿越格數(shù)（四爪均進(jìn)入的方格方可記數(shù)，為水平運(yùn)動得分）、后肢直立次數(shù)（兩前爪騰空或攀附墻壁，為垂直運(yùn)動得分），徹底清潔敞箱后再進(jìn)行下一只豚鼠的觀察。實(shí)驗(yàn)要求在單盲的條件下進(jìn)行，減少人為的誤差。觀察指標(biāo)：豚鼠穿格次數(shù)、理毛時(shí)間和次數(shù)、直立次數(shù)。反復(fù)進(jìn)行4次，每次間隔3min。取后3次的數(shù)據(jù)計(jì)算平均數(shù)用于統(tǒng)計(jì)處理。

1.4.2 甩尾實(shí)驗(yàn)[12]：用一塊軟布輕輕裹住實(shí)驗(yàn)豚鼠的身軀僅露出尾巴， 使之不能逃脫但不能過于束縛。將鼠尾尖端約1.5cm 部分浸入53℃的水浴內(nèi)， 同時(shí)用秒表測出鼠尾從浸入到甩出水面的時(shí)間（精確到0.1s）。連續(xù)做4 次， 每次間隔30s。統(tǒng)計(jì)取后3 次的數(shù)據(jù)計(jì)算平均數(shù)。

1.4.3 液體消耗試驗(yàn)[13]：實(shí)驗(yàn)第25天在隔噪音、安靜的房間內(nèi)，訓(xùn)練動物適應(yīng)含糖飲水， 每籠同時(shí)放置2 個(gè)水瓶，第一個(gè)24h，兩瓶均裝有1% 蔗糖水， 隨后的24h，一個(gè)瓶裝1%蔗糖水，一個(gè)瓶裝純水。第27天23 h的禁食禁水，第28天進(jìn)行動物的基礎(chǔ)糖水/ 純水消耗試驗(yàn)， 同時(shí)給予每只豚鼠定量好的兩瓶水：一瓶1%蔗糖水，一瓶純水。24h后取走兩瓶并稱重。第29天計(jì)算動物的總液體消耗、糖水消耗、純水消耗、糖水偏愛（糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×100%）。

1.4.4 體質(zhì)量變化：觀察不同因素刺激下豚鼠體質(zhì)量增加的區(qū)別，分別測量每組豚鼠在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)和第28天試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的體質(zhì)量，并進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，計(jì)量數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)。組間差異的顯著性檢驗(yàn)運(yùn)用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察實(shí)驗(yàn)豚鼠照射情況：紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組造模動物1周后出現(xiàn)精神差、反應(yīng)遲鈍、進(jìn)食減少、體重下降、毛發(fā)易脫落、小便量增多。兩周后紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組較其他組上述癥狀明顯加重，相比空白組豚鼠精神好、反應(yīng)敏捷、毛發(fā)濃密有光澤、飲食、大小便正常。除空白對照組以外，其余四組第28天，背部皮膚色素沉著加深，呈灰褐色。紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組較其他組明顯。

2.2 皮膚黑素細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)觀察：與空白組（圖1A）比較，紫外線組豚鼠皮膚HMB45標(biāo)記陽性的黑素細(xì)胞少量增多，表皮基底細(xì)胞和棘細(xì)胞層中可見單個(gè)散在分布的黑素細(xì)胞（圖1B）；黃體酮組豚鼠皮膚表皮基底層和棘細(xì)胞層中可見散在少量分布的HMB45標(biāo)記陽性的黑素細(xì)胞（圖1C）；紫外線+黃體酮組豚鼠皮膚表皮基底層和棘細(xì)胞層中可見多個(gè)散在分布的HMB45標(biāo)記陽性的黑素細(xì)胞（圖1D）；紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組豚鼠皮膚HMB45標(biāo)記陽性的黑素細(xì)胞明顯增多，多個(gè)成簇分布于表皮基底細(xì)胞和棘細(xì)胞層中，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)（圖1E）。

2.3 黑素陽性目標(biāo)的計(jì)算機(jī)圖像分析

2.3.1各組豚鼠皮膚黑素細(xì)胞個(gè)數(shù)、數(shù)密度比較：各組豚鼠皮膚黑素細(xì)胞的個(gè)數(shù)均較空白組有所增加，其中紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組有極顯著性差異（P<0.01）。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組黑素細(xì)胞個(gè)數(shù)與其他各組有顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=266.729，P<0.01）。各組數(shù)密度明顯高于空白組，尤其是紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組可見與空白組有極顯著差異（P<0.01）。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組數(shù)密度與其他各組有顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=84.896，P<0.01）（表1）。

2.3.2各組豚鼠表皮黑色素沉著深淺度[14]：結(jié)果顯示，與空白組比較，其他四組的平均光密度值均較空白組升高，除黃體酮組外平均灰度值較空白組有所下降。其中，紫外線+黃體酮組和紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組豚鼠平均光密度值、平均灰度值有極顯著性差異（P<0.01）。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組平均光密度值、平均灰度值與其他各組有顯著差異，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.399，P<0.01；F=39.011，P<0.01）（表2）。

2.4行為學(xué)測試

2.4.1敞箱實(shí)驗(yàn)：黃體酮+紫外線+應(yīng)激抑郁組的穿格次數(shù)、直立次數(shù)、理毛時(shí)間、理毛次數(shù)均較空白組有所減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其他組與空白組差異性比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）提示慢性不可預(yù)見性的應(yīng)激刺激28天后的豚鼠出現(xiàn)了抑郁的現(xiàn)象（表3）。

2.4.2 甩尾實(shí)驗(yàn)：紫外線+黃體酮組和紫外線+黃體酮+應(yīng)激抑郁組甩尾時(shí)間均較空白組顯著延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組甩尾時(shí)間與其他各組有顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.469，P<0.01）（表4）。

2.4.3體質(zhì)量增加的計(jì)算：在造模的28天中，各組豚鼠的體質(zhì)量均有所增加。紫外線+黃體酮組和黃體酮+紫外線+應(yīng)激抑郁模型組較正常組的體質(zhì)量增加量有所減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組體質(zhì)量增加量較其他各組顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.664，P<0.01）。進(jìn)一步提示慢性應(yīng)激刺激法導(dǎo)致抑郁后對體質(zhì)量的影響最大（表5）。

2.4.4糖水消耗實(shí)驗(yàn)：慢性應(yīng)激刺激對豚鼠液體消耗實(shí)驗(yàn)的影響，黃體酮十紫外線+抑郁模型組的糖水消耗顯著低于空白組（P<0.05），各組總液體消耗無明顯差異（P>0.05）。紫外線+黃體酮組糖水消耗和糖水偏愛百分比顯著低于空白組（P<0.05）。紫外線+黃體酮+應(yīng)激抑郁組糖水消耗、糖水偏愛百分比均極顯著低于空白組（P<0.01）。純水消耗顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表6）。

2.5對皮膚MDA、SOD 含量的影響：在5組中，紫外線+黃體酮組和紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組模型豚鼠皮膚的MDA水平均較正常組升高，SOD活性較正常組有所下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組豚鼠皮膚MDA、SOD較其他組顯著性差異（F=19.763，P<0.01；F=53.264，P<0.01）。提示此種模型建立對于豚鼠皮膚MDA、SOD的活性影響非常大（表7）。

2.6 酪氨酸含量測定：紫外線+黃體酮組和紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組酪氨酸含量與空白組比較明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。采用單因素方差分析紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組酪氨酸含量較其他各組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=59.552，P<0.01）（表8）。

3 討論

普遍認(rèn)為黃褐斑發(fā)病原因可能與紫外線照射、遺傳因素、情緒變化、內(nèi)分泌失調(diào)、藥物等多種因素密切相關(guān)[15]，現(xiàn)階段雖然治療方法較多，但療效較差。因此，進(jìn)一步客觀研究黃褐斑動物模型在研究黃褐斑的治療機(jī)制過程中有著重要的意義。查閱以往文獻(xiàn)黃褐斑動物模型都是從單一的致病機(jī)制來建立黃褐斑動物模型，研究結(jié)果也只是從一個(gè)方面來反映了疾病的表現(xiàn)，因此不能綜合全面的表達(dá)黃褐斑病因病機(jī)。趙廣等[15]調(diào)查200例黃褐斑患者研究發(fā)現(xiàn)，自覺黃褐斑的發(fā)生和加重與情緒抑郁相關(guān)的患者占54.5%。其中有部分患者面部黃褐斑是由于家中突發(fā)的惡性事件所誘發(fā)的。所以黃褐斑動物模型中應(yīng)該考慮情緒抑郁導(dǎo)致的發(fā)病因素，汪南玥等[16]考慮到黃褐斑的中醫(yī)辨證分型中以肝郁型為多見，采用雌激素全身攻擊、慢性束縛法、局部紫外光照射法建立多因素黃褐斑豚鼠肝郁模型，其豚鼠皮膚黑素細(xì)胞和MDA、SOD等客觀指標(biāo)的變化較其他模型也更加類似人類黃褐斑的病變和表現(xiàn)。目前廣泛應(yīng)用慢性輕度不可預(yù)見的應(yīng)激來模擬制作抑郁癥動物模型， 更類似于人類抑郁癥發(fā)病機(jī)理[17]。研究表明抑郁癥的首要促發(fā)因素是長期、低強(qiáng)度的日常應(yīng)激性生活事件，而且在制作抑郁動物模型中，模型成功的關(guān)鍵是應(yīng)激因素的多變性和不可預(yù)測性， 并且沒有一種應(yīng)激因子單獨(dú)應(yīng)用可產(chǎn)生理想效應(yīng)， 反之沒有一種應(yīng)激因素是抑郁模型成功所必不可少的[18]。所以單一的慢性束縛法造成抑郁，某種程度上很難具備典型抑郁模型的特征，但為筆者制作更加科學(xué)的黃褐斑動物模型提供了思路。綜合其諸多因素的考慮，因此建立更加科學(xué)的黃褐斑動物模型，不僅僅是病理狀態(tài)上的相似性，還因考慮精神方面的因素。建立多因素黃褐斑動物模型更全面體現(xiàn)黃褐斑的病理機(jī)制。

皮膚黑色素病理形態(tài)學(xué)研究結(jié)果與生化指標(biāo)檢測是判斷黃褐斑的動物模型是否成功最主要指標(biāo)。而前者是直接、最客觀的指標(biāo)。光鏡下可見各組間比較紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組黑色素細(xì)胞較空白組豚鼠黑素陽性細(xì)胞明顯增多，與過偉峰等結(jié)果一致[6]。計(jì)算機(jī)病理圖象學(xué)定量分析結(jié)果顯示， 紫外線+黃體酮+慢性應(yīng)激抑郁組同其他組比較豚鼠數(shù)密度、平均光密度值、平均灰度值有極顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其MDA、SOD等生化指標(biāo)檢測與黃褐斑主要臨床特征類似。說明多重因素造模后較其他單一因素組豚鼠黃褐斑動物模型更加接近人類黃褐斑變病特征，并且具有抑郁癥的行動學(xué)表現(xiàn)。該模型的建立為將來探討黃褐斑動物模型提供了基礎(chǔ)和思路，為研究黃褐斑治療方法提供了較為理想的動物模型。

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[收稿日期]2012-12-05 [修回日期]2013-01-26

編輯/張惠娟