人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞研究及其在心血管組織工程中的應(yīng)用現(xiàn)狀

間充質(zhì)干細(xì)胞（ mesenchymal stem cells，MSCs）是干細(xì)胞家族的重要成員，來(lái)源于早期中胚層和外胚層的一類(lèi)多能干細(xì)胞。MSCs最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，隨后在多種組織中分離得到，包括肌肉、脂肪、大腦、軟骨、牙髓以及臍帶等[1]。大量研究表明，MSCs具有巨大的治療潛力，因?yàn)槠渚哂凶晕腋潞投嘞蚍只臐撃?，在體內(nèi)或體外的合適條件下能分化成為多種成體細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)組織重建；能夠通過(guò)分泌可溶性因子和轉(zhuǎn)分化等直接或間接刺激進(jìn)行組織修復(fù)[2]。MSCs還具有免疫調(diào)節(jié)能力，體外擴(kuò)增的MSCs具有免疫抑制功能，可通過(guò)與免疫細(xì)胞（如：T和B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞等）的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，可能成為某些免疫性疾?。ㄈ纾篊rohn's?。┑闹委熓侄危瑢?duì)于減少造血干細(xì)胞及器官移植后的移植物抗宿主?。?GVHD ）的發(fā)生也有一定的作用[3]。另外，MSCs在連續(xù)傳代和冷凍復(fù)蘇后仍具有上述功能，可作為組織工程和細(xì)胞替代治療的種子細(xì)胞[4]。

研究表明，圍產(chǎn)期胚外組織中均含有MSCs，包括胎盤(pán)的各個(gè)部分、胎膜（羊膜和絨毛膜）和臍帶，從臍帶血和羊水中也能分離得到，這種MSCs是一種介于胚胎干細(xì)胞（ embryonic stem cells， ESCs ）和成體MSCs之間的干細(xì)胞類(lèi)型，其生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)系與ESCs很接近，免疫原性較低，具有廣泛的可塑性，而且比成體MSCs增殖得更快[5]。另外，用于分離細(xì)胞的胚外組織在分娩后通常會(huì)被丟棄，不會(huì)有倫理學(xué)方面的問(wèn)題。臍帶動(dòng)靜脈之間含有特殊的胚胎粘液樣結(jié)締組織 — 沃頓膠（ Whanon's jelly ），由沃頓膠分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞即為人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞（ WJ-MSCs ）。這種來(lái)源廣泛、再生能力強(qiáng)、有較強(qiáng)分化潛能、免疫原性低的干細(xì)胞，近年來(lái)引起人們的極大興趣，特別是其對(duì)于再生能力非常有限的心血管組織的恢復(fù)與重建，研究者們進(jìn)行了很多基礎(chǔ)和臨床研究，現(xiàn)將WJ-MSCs的研究進(jìn)展及其在心血管組織工程中的應(yīng)用綜述如下：

1 WJ-MSCs的來(lái)源

最初，人們從臍帶血、羊水和胎膜獲取細(xì)胞，用于圍產(chǎn)期的一些診斷。20世紀(jì)80年代，開(kāi)始應(yīng)用圍產(chǎn)期干細(xì)胞治療白血病和代謝性疾病，1例患者應(yīng)用HLA匹配的臍帶血（來(lái)自患者的兄弟）治療范科尼貧血獲得成功[6]。從此以后，全世界成功實(shí)施了超過(guò)10 000例臍帶血移植術(shù)[7]。20世紀(jì)90年代，Langer's和 Vacanti 兄弟提出了再生醫(yī)學(xué)的概念[8]，之后不久，圍產(chǎn)期胚外組織MSCs便被證明可以應(yīng)用于組織工程。臍帶是連接胎兒和胎盤(pán)的彈性索狀結(jié)構(gòu)，功能是保護(hù)其中的血管免受壓迫、扭轉(zhuǎn)和彎曲，同時(shí)也連接著胎兒和母體的血液循環(huán)。臍帶包括兩根臍動(dòng)脈和一根臍靜脈，它們鑲嵌在一種富含蛋白多糖的特殊膠狀基質(zhì)-沃頓膠中，后者表面覆蓋著羊膜上皮。沃頓膠是一種果凍樣結(jié)締組織，主要成分為Ⅰ和Ⅲ型膠原纖維，以及富含粘多糖的膠狀細(xì)胞間質(zhì)。膠原蛋白形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與無(wú)定形的細(xì)胞間質(zhì)呈松散的連接，細(xì)胞間質(zhì)中則包含數(shù)種多聚糖，如：透明質(zhì)酸等[9]。

早期研究表明，沃頓膠中含有一種成纖維細(xì)胞樣、多能間充質(zhì)干細(xì)胞群。這些細(xì)胞以前稱(chēng)為“臍帶基質(zhì)干細(xì)胞”，用來(lái)與分離自臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞（ HUVEC ）和臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞（ UCB-MSCs ）相區(qū)別，之后則被稱(chēng)為“沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞”（ WJ-MSCs ）[10]。目前，WJ-MSCs可分別源自臍帶的三個(gè)區(qū)域：即血管周?chē)鷧^(qū)、血管內(nèi)區(qū)和亞羊膜區(qū)，各個(gè)區(qū)域分離得到的細(xì)胞在精細(xì)結(jié)構(gòu)、免疫組化和體外功能方面的研究結(jié)果表明，三者無(wú)論是數(shù)量還是性質(zhì)方面均有明顯的差異，由此可推測(cè)這些區(qū)域的細(xì)胞來(lái)源可能并不相同。而來(lái)自臍帶不同部分的成纖維樣細(xì)胞是否來(lái)源和性質(zhì)也不相同，目前仍不清楚。這些細(xì)胞表達(dá)相似的表面標(biāo)志，提示其均為MSCs來(lái)源[11]。有研究表明，靠近羊膜表面的WJ-MSCs增殖能力更強(qiáng)，而靠近鄰近臍靜脈的WJ-MSCs則有更廣泛的分化潛能[12]。

2 WJ-MSCs的分離和培養(yǎng)

目前，分離WJ-MSCs主要的方法有組織塊培養(yǎng)法和酶消化法[13]。先取15～20cm新鮮臍帶，去除臍靜脈和臍動(dòng)脈，分離沃頓膠并切碎。組織培養(yǎng)法即是將組織碎塊直接置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，酶消化法則用蛋白酶（如膠原酶和透明質(zhì)酸酶）將組織碎塊消化后，用70～100um細(xì)胞篩過(guò)濾，再重懸于培養(yǎng)基中。酶消化法的優(yōu)點(diǎn)是得到的細(xì)胞比較純，可減少分離沃頓膠時(shí)其他細(xì)胞（如：紅細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等）和組織碎片的污染風(fēng)險(xiǎn)[14]。新鮮分離的WJ-MSCs接種后0～3天處于潛伏期，細(xì)胞無(wú)明顯增殖，第4天進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，10～15天后進(jìn)入平臺(tái)期，此時(shí)通常呈成纖維細(xì)胞樣。在平臺(tái)期，細(xì)胞的倍增時(shí)間為60～85h，且基本保持穩(wěn)定，到了生長(zhǎng)晚期則呈進(jìn)行性減少[15]。

3 WJ-MSCs的生物學(xué)特性

一方面，WJ-MSCs能滿(mǎn)足成體MSCs定義的最低標(biāo)準(zhǔn)，形態(tài)上類(lèi)似成體MSCs，具有粘附特性，能夠自我更新，并能在體外培養(yǎng)增殖。表形上，WJ-MSCs表達(dá)典型的MSCs表面標(biāo)志，如：CD10、CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105，同時(shí)不表達(dá)造血細(xì)胞系的表面標(biāo)志，如：CD34和CD45[16]。在可塑性方面，WJ-MSCs具有多能分化性，能被誘導(dǎo)成為脂肪組織、骨、軟骨、骨骼肌細(xì)胞、心肌樣細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等。另一方面，WJ-MSCs又具有圍產(chǎn)期胚外MSCs的典型特性，與胎盤(pán)來(lái)源MSCs（ PD-MSCs ）和臍帶血來(lái)源MSCs（ UCB-MSCs ）均非常相似。第一，它們均具有多能分化性，且增殖速度快，在體外的增殖潛能比成體MSCs大80倍以上；第二，它們表面表達(dá)HLA-Ⅰ分子較成體MSCs低，并且不表達(dá)HLA-Ⅱ分子[11]；第三，它們較成體MSCs具有更廣泛的分化潛能，據(jù)最新研究表明，WJ-MSCs能夠分化為源自?xún)?nèi)胚層的組織，如：胰腺和肝臟[17-18]。與臍帶血來(lái)源的MSCs相似，WJ-MSCs在體外也能分化為骨和神經(jīng)細(xì)胞[12]。與成體MSCs和PD-MSCs不同， WJ-MSCs持續(xù)表達(dá)胚胎干細(xì)胞的表面標(biāo)志，如：Oct-4、Sox-2和Nanog，也表達(dá)多能性干細(xì)胞的表面標(biāo)志，如：SSeA-4和Tra-1-60。此外，WJ-MSCs在免疫調(diào)節(jié)方面比成體MSCs具有更廣泛的特性。例如：在混合淋巴細(xì)胞試驗(yàn)中，WJ-MSCs會(huì)抑制T細(xì)胞的增殖，因此能更好地耐受外源性的移植[3]。綜上所述，WJ-MSCs是一種可靠的、豐富的、廉價(jià)來(lái)源的多能間充質(zhì)干細(xì)胞，在再生醫(yī)學(xué)中具有較大的應(yīng)用潛力。

4 WJ-MSCs在心血管組織工程中的應(yīng)用

心血管系統(tǒng)的再生能力非常有限，功能性置換是治療心血管損傷和先天缺陷的重要手段，尤其對(duì)于新生兒和嬰幼兒更是如此。目前，實(shí)施手術(shù)是較為普遍的治療手段，然而，手術(shù)治療通常使用的置換物為異體的瓣膜或脈管，該類(lèi)置換物有兩個(gè)顯著的缺點(diǎn)：阻塞性組織向內(nèi)生長(zhǎng)和植入物的鈣化，因此每次手術(shù)都會(huì)有一定的風(fēng)險(xiǎn)。研究者希望能夠在體外培養(yǎng)心血管組織的替代品，以解決這一難題[19]。通常有兩種成體細(xì)胞作為種子細(xì)胞用于制造心血管組織的替代品，一種為能夠形成細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞，如：成纖維細(xì)胞；另一種為具有抗血栓功能的內(nèi)皮細(xì)胞。在三維支架上先種植成纖維細(xì)胞，再種植內(nèi)皮細(xì)胞[20]。與成纖維細(xì)胞相比，WJ-MSCs有更好的自我修復(fù)能力，更廣泛的可塑性和具有免疫調(diào)節(jié)能力，而且，它還具有諸多優(yōu)勢(shì)，如：其來(lái)源為自體組織、來(lái)源豐富、獲得手段對(duì)人體幾乎沒(méi)有傷害、生長(zhǎng)迅速等，因此，WJ-MSCs很有希望代替成纖維細(xì)胞成為新的種子細(xì)胞用于培育心血管組織替代品。另外，另一種所必需的細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞也能夠從臍帶靜脈或臍帶血中分離得到。從2002年起[21]，研究者開(kāi)始探尋WJ-MSCs在心血管組織工程中的可行性，隨后的研究表明，其為一種較好的細(xì)胞來(lái)源[22]。2006年，Schmidt 等[23]應(yīng)用異體產(chǎn)前臍帶來(lái)源的祖細(xì)胞作為細(xì)胞源，培育出了具有生物活性的心臟瓣膜小葉。研究者將WJ-MSCs和臍血來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞（ EPCs ）種植在生物可降解支架上，在模擬體內(nèi)生理的環(huán)境中培養(yǎng)，并施加化學(xué)和（或）物理刺激，最終形成了成熟、分層的小葉組織，其具有與天然組織相似的功能性血管內(nèi)皮和細(xì)胞外基質(zhì)成分。該研究對(duì)于缺乏自體可再生細(xì)胞的先天性心臟缺陷的治療具有重要意義。2010年，有研究者率先將微膠囊化技術(shù)運(yùn)用于WJ-MSCs[24]。微膠囊具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如：外表為球型結(jié)構(gòu)，具有更大的表面體積比率；可以設(shè)定滲透性，允許參與合成代謝的化合物（如O2、葡萄糖等）進(jìn)入和細(xì)胞的代謝產(chǎn)物（如：CO2、乳酸、激素等）排出，同時(shí)不允許免疫球蛋白進(jìn)入；可以直接注射或通過(guò)微創(chuàng)手術(shù)植入到多種組織和器官。研究者比較了自由WJ-MSCs和微膠囊化WJ-MSCs在性質(zhì)和功能方面的差別，結(jié)果表明，微膠囊化并不會(huì)改變WJ-MSCs的表形，也不影響其生存能力，這就為體內(nèi)利用WJ-MSCs提供了一種新的可能途徑。最近，Kenar等[25]將WJ-MSCs合并微纖維支架用于修復(fù)心肌梗死或減緩心肌組織破環(huán)。研究者使用了一種由可生物降解的大空隙管道組成的支架，將WJ-MSCs作為種子細(xì)胞種植其上，然后在流動(dòng)培養(yǎng)液中培養(yǎng)14天，最終的數(shù)據(jù)顯示，WJ-MSCs的生存能力得到了加強(qiáng)，細(xì)胞的同質(zhì)性和分布均勻程度都有所提高。

5 展望

基于干細(xì)胞的再生醫(yī)學(xué)，為組織器官損傷的治療和重建邁出了革命性的一步，分離和鑒定新的干細(xì)胞來(lái)源對(duì)于再生醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用也至關(guān)重要。越來(lái)越多的研究表明，源自臍帶的WJ-MSCs是介于胚胎干細(xì)胞和成體MSCs的一種干細(xì)胞，它結(jié)合了兩者的優(yōu)點(diǎn)，一方面比成體MSCs在體外的擴(kuò)增效率更高、分化能力更強(qiáng)、免疫原性更低；另一方面又避免了胚胎干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)倫理學(xué)上的問(wèn)題，而且來(lái)源充足，對(duì)于供者沒(méi)有創(chuàng)傷和其他臨床風(fēng)險(xiǎn)。這些優(yōu)勢(shì)使得WJ-MSCs在組織工程領(lǐng)域具有巨大的潛力，特別是對(duì)于心血管系統(tǒng)這樣再生能力非常有限的組織重建，可以說(shuō)是最有前途的研究方向之一。目前，將WJ-MSCs用于臨床還存在種種困難，如：移植后在宿主體內(nèi)難以長(zhǎng)期存活、分化為目的細(xì)胞的效率較低等，因此，有必要建立分離、鑒定和長(zhǎng)期培養(yǎng)WJ-MSCs的臨床相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，使其在再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用中得到更廣泛、更深入的研究。

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[收稿日期]2012-11-10 [修回日期]2013-01-14

編輯/李陽(yáng)利