南海紅樹(shù)林內(nèi)生真菌Gx—4c代謝產(chǎn)物研究

摘要：采用反復(fù)硅膠柱色譜法、Sephadex LH-20凝膠色譜法等進(jìn)行南海紅樹(shù)林內(nèi)生真菌Gx-4c的代謝產(chǎn)物分離純化，并通過(guò)理化常數(shù)測(cè)定和光譜分析鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果： 從南海紅樹(shù)林內(nèi)生真菌Gx-4c的菌體中分離得到4個(gè)代謝產(chǎn)物，經(jīng)波譜解析，分離得到的4個(gè)化合物分別為：5，7-二羥基-2-甲基色原酮 （1）、 3 -羥基-2-甲基苯酸 （2）、3，4-二氫-8-羥基-3-甲基-1H-2-苯吡喃-1-酮-5-羧酸（3）、3，4-二氫-8-羥基-3，5-二甲基-1H-2-苯吡喃-1-酮（4）；初步藥理活性顯示化合物1對(duì)口腔癌細(xì)胞KB、KBv200的抗腫瘤活性值分別為7.5和11.2 Mol。研究結(jié)果表明：所有化合物均首次從南海紅樹(shù)林內(nèi)生真菌Gx-4c中分離得到。

關(guān)鍵詞：紅樹(shù)林；內(nèi)生真菌；代謝產(chǎn)物

中圖分類號(hào)：O629文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1003-4374（2013）01-0012-03

紅樹(shù)林是指生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶潮間帶上部，以紅樹(shù)植物為主體的常綠灌木或喬木組成的淺灘濕地木本生物群落，是一種陸地向海洋過(guò)渡的特殊生態(tài)系統(tǒng)[1] ，紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)中蘊(yùn)藏著豐富的動(dòng)植物資源和微生物資源。紅樹(shù)林棲息地被證明是真菌新種屬的豐富來(lái)源， 形成了海洋真菌第二大生態(tài)學(xué)亞類。我們實(shí)驗(yàn)小組已從中國(guó)南海紅樹(shù)林內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離到大量新穎的有活性結(jié)構(gòu)的化合物[ 2-4] 。

本文對(duì)南海紅樹(shù)林內(nèi)生真菌Gx-4c代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，從菌體中分離得到4個(gè)化合物：5，7-二羥基-2-甲基色原酮（1）、3 -羥基-2-甲基苯酸 （2）、3，4-二氫-8-羥基-3-甲基-1H-2-苯吡喃-1-酮-5-羧酸（3）、3，4-二氫-8-羥基-3，5-二甲基-1H-2-苯吡喃-1-酮（4），初步藥理活性顯示化合物1對(duì)口腔癌細(xì)胞KB、KBv200的抗腫瘤活性值分別為7.5和11.2Mol。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器和試劑

美國(guó)Varian公司INOVA-500NB超導(dǎo)核磁共振譜儀和INOVA-300NB核磁共振儀，VG ZAB-HS雙聚焦質(zhì)譜儀，Thermo DSQ電子轟擊電離質(zhì)譜儀，Thermo MAT95XP高分辨質(zhì)譜儀；北京泰克儀器有限公司的X-4數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀。所用試劑均為廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，化學(xué)純、溶劑經(jīng)重蒸后使用。柱層析硅膠為青島海洋化工廠生產(chǎn)的200-300目硅膠、硅膠H、 薄層硅膠GF254。

1.2菌種培養(yǎng)

紅樹(shù)林內(nèi)生真菌Gx-4c采自中國(guó)香港，經(jīng)鑒定為擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsis sp.），保存于中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院。發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、酵母膏1g/L、粗海鹽2g/L，pH7.0。500mL三角瓶?jī)?nèi)裝培養(yǎng)基250mL，1.25×105Pa 滅菌20 min后接種120L，在25℃靜置培養(yǎng)35d，分別收集發(fā)酵液和菌體。

1.3提取與分離

200L發(fā)酵物過(guò)濾得菌體和發(fā)酵液，發(fā)酵液濃縮后用乙酸乙酯充分萃取，菌體用甲醇多次浸泡。提取濃縮物分別以體積比1∶2拌硅膠（200-300目）進(jìn)行柱層析，以石油醚/乙酸乙酯/甲醇進(jìn)行梯度加壓洗脫。收集各組分再經(jīng)反復(fù)柱層析、制備薄層層析、重結(jié)晶等方法進(jìn)行純化。從菌體粗提物（約40g）分離得到化合物1 （ 8mg）、2 （10mg）、3 （7mg）、 4 （8mg） 。

1.4細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)：

[1] 李倩茹， 李皓. 一株抗菌活性的紅樹(shù)林植物內(nèi)生真菌的分離與鑒定[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2009， 21（7）：143-145.

[ 2] Lin Y C，Wu X Y， Feng S ， et al. Five Unique Compounds： Xyloketals fro m angrove Fungus Xylaria sp.from the South Chna Sea Coast[ J]. J Org Chem， 2001， 66 ： 6252-6256.

[ 3] Lin Y C， Wu X Y， Feng S ， et al . 1A novel N- cinnamoylcycl opepti decontai ning an all enic et her fro m t he f ungusXy l aria s p . （ strain #2508） from the Sout h Chi na Sea [ J]. Tetrahedron Letters， 2001， 42 ： 449-451.

[ 4] Chen G Y， Lin Y C， Wen L ， et a. l Two new m etabo lites o f a marine endophytic f ungus （ No11893 ） from an estuarine mangrove on the South China Sea coast[ J]. Tetrahedron， 2003 ， 59 ： 4907-4909.

[5] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival applica tion to proliferation and cytotoxicity assays [J]. Journal of immunological me thods， 1983， 65 （1-2）： 55-63.

[6] Jingqiu Dai， Karsten Krohn， Ulrich Florke， Siegfried Draeger， Barbara Schulz， Attila Kiss-Szikszai， Sándor Antus， Tibor Kurtán， Teunis van Ree. Metabolites from the Endophytic Fungus Nodulisporium sp. From Juniperus cedre[J]. Eur. J. Org. Chem. 2006，15：3498-3506.

[7] Dean RE， Midgley A， White EN， et al. Synthesis of some new phenols. J. Chem. Soc.， 1961： 2773-2779.

[8] Chinworrungsee M， Kittakoop P， Isaka M， Rungrod A， Tanticharoen M， Thebtaranonth Y. Antimalarial halorosellinic acid from the marine fungus Halorosellinia oceanica. Bioorganic Medicinal Chemistry Letters， 2001， 11：1965-1969.