JNK 調(diào)控阻塞性睡眠呼吸暫停合并高血壓模式研究

張 可，陳 靜，周 燕

（1.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科/呼吸疾病實驗室，廣西 桂林 541000；2.泰安市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，山東 泰安 271000）

阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）是一種發(fā)病率日益增高的睡眠呼吸疾病，其病理生理學特點為間歇性低氧，與高血壓密切相關(guān)[1]。血管重構(gòu)與高血壓密切相關(guān)，而血管內(nèi)皮細胞表型轉(zhuǎn)化是血管重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)[2]，阻斷其發(fā)生發(fā)展是治療高血壓的重要途徑，越來越受到臨床的關(guān)注[3]。研究表明[4]，氧化應(yīng)激會激活JNK 信號通路，是體內(nèi)高血壓進展的重要病理生理途徑，介導著血管重構(gòu)的發(fā)生。本研究通過觀察間歇性低氧能否調(diào)控JNK信號通路引起高血壓，并探討其可能作用機制，旨在為治療OSA 合并高血壓提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物購自廣西醫(yī)科大學-廣西實驗動物中心，雄性8 周齡SD 大鼠共36 只，體重160～200 g，隨機均分為四組：常氧對照組、常氧干預(yù)組、間歇性低氧組、間歇性低氧干預(yù)組，各9 只。

1.2 實驗儀器與試劑 低壓氧艙；動脈血壓測量儀；光學顯微鏡；基因擴增儀：TC020A-230V；穩(wěn)壓電泳儀：DYY-6D型；蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)：TE22型；數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)：JS-780型；數(shù)字圖像分析系統(tǒng)：IPP-5.0 形態(tài)學分析軟件；Trizol RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；JNK 阻滯劑：SP600125[5]；JNK-1 山羊抗小鼠多克隆抗體；BCA 蛋白濃度測定試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 將造模組大鼠放置于低氧艙內(nèi)，每日固定時間循環(huán)充入氮氣和氧氣8 h，具體方法為首先充入氮氣30 s，在30 s 內(nèi)將氧濃度下降至4%～6%，保持該氧濃度1 min 使大鼠處于缺氧狀態(tài)，然后充入氧氣10 s，使氧濃度恢復至21%，保持20 s，持續(xù)2 min。常氧對照組及常氧對照干預(yù)組大鼠將充入氣體更改為空氣，進行相同處理，該處理持續(xù)12 周；常氧干預(yù)組及間歇性低氧干預(yù)組大鼠每天以30 mg/kg 的SP600125 進行灌胃，對剩余兩組大鼠行生理鹽水灌胃。

1.3.2 血壓測定 在實驗過程中，每周固定時間進行對鼠尾平均動脈血壓（MAP）進行測定，測量3 次血壓后取3 次血壓的平均值。

1.3.3 病理學檢測 不同組別大鼠處死后分離腹主動脈，固定標本后進行染色，觀察腹主動脈病理學改變，并測量各組腹主動脈中膜厚度（MT）、管腔直徑（LD）、兩者比值以及中膜膠原纖維面積百分比。

1.3.4 Western blot 法檢測JNK-1 蛋白在大鼠腹主動脈組織中的表達 稱取各組大鼠腹主動脈10 mg 左右，經(jīng)研磨-裂解-震蕩-離心后吸取上清液測定蛋白濃度，最后通過Western blot 檢測腹主動脈中JNK-1 蛋白水平。

1.3.5 RT-PCR 法檢測JNK-1mRNA 在大鼠腹主動脈組織中的表達 取各組大鼠腹主動脈組織稱重，選取等重量組織在低溫條件下研磨至粉末狀，按說明依次進行RNA 提取-測定RNA 純度及完整度-RNA 逆轉(zhuǎn)錄-RT-PCR 進行JNK-1mRNA 目的基因片段擴增-RT-PCR 產(chǎn)物電泳。目的片段的相對表達量=JNK-1mRNA 的灰度值/β-actin 的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學處理 用SPSS 21.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓變化情況 與同周齡常氧對照組大鼠比較，自造模2 周后，間歇性低氧組大鼠血壓升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與同周齡間歇低氧組大鼠比較，間歇性低氧干預(yù)組大鼠血壓下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；間歇性低氧干預(yù)組大鼠血壓與同周齡常氧對照組大鼠比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠血壓變化情況（，mmHg）

表1 各組大鼠血壓變化情況（，mmHg）

注：與常氧對照組比較，*P＜0.05；與間歇性低氧組比較，△P＜0.05

2.2 各組大鼠腹主動脈病理結(jié)果比較 各組大鼠腹主動脈內(nèi)膜MT、LD、MT/LD 及中膜膠原纖維面積百分比變化情況見表2。與間歇性低氧組比較，間歇性低氧干預(yù)組大鼠腹主動脈無明顯內(nèi)膜破壞，動脈中膜血管平滑肌細胞（VSMCs）數(shù)量下降（P＜0.05），腹主動脈未見中層彈性膜明顯增加，層次排列較整齊，壁層厚度較統(tǒng)一，層次較分明，未見平滑肌纖維破裂；與同培養(yǎng)時間常氧干預(yù)組大鼠比較，間歇性低氧干預(yù)組大鼠腹主動脈中膜血管平滑肌細胞（VSMCs）層數(shù)無明顯增加或減少（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠腹主動脈病理結(jié)果比較

表2 各組大鼠腹主動脈內(nèi)膜各指標變化情況（）

表2 各組大鼠腹主動脈內(nèi)膜各指標變化情況（）

注：與常氧對照組比較，*P＜0.05；與間歇性低氧組比較，△P＜0.05

2.3 各組大鼠腹主動脈JNK-1mRNA RT-PCR 表達比較 四組均于138 bp 處出現(xiàn)JNK-1mRNA 表達條帶，其中間歇性低氧組表達量高于常氧對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在兩間歇性低氧組中，間歇性低氧干預(yù)組JNK-1mRNA 表達量低于間歇性低氧組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與常氧干預(yù)組比較，間歇性低氧干預(yù)組JNK-1mRNA 表達量增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠腹主動脈JNK-1mRNA RT-PCR 表達比較

2.4 各組大鼠胰腹主動脈JNK-1 蛋白Westernblot結(jié)果比較 與常氧對照組比較，間歇性低氧組JNK-1 蛋白表達水平增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與常氧對照組比較，間歇性低氧干預(yù)組JNK-1 蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與常氧干預(yù)組比較，間歇低氧干預(yù)組JNK-1 蛋白表達水平增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠胰腹主動脈JNK-1 蛋白WesternBlot 結(jié)果比較

3 討論

OSA 是一種發(fā)病率日益增長的呼吸睡眠疾病，目前我國OSA 患者已達6600 萬[6]。OSA 患者在睡眠時反復出現(xiàn)上氣道完全或部分堵塞，進而出現(xiàn)間歇性低氧表現(xiàn)，是高血壓的獨立危險因素[7]。研究表明[8]，OSA 主要通過激活交感神經(jīng)系統(tǒng)、激活RASS系統(tǒng)、增加氧化應(yīng)激、損傷內(nèi)皮及全身炎癥反應(yīng)等方式導致高血壓的發(fā)生。另有研究表明[9，10]，高血壓的主要病理特點為血管內(nèi)皮功能障礙，血管收縮增加和血管重構(gòu)，而VSMCs 表型轉(zhuǎn)化與血管重構(gòu)密切相關(guān)，其主要通過免疫及炎癥反應(yīng)進行調(diào)節(jié)。由此推測，OSA 可能通過某種信號通路對VSMCs 進行調(diào)控，進而影響血管重構(gòu)及高血壓的發(fā)生。

c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號轉(zhuǎn)導通路是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號轉(zhuǎn)導通路中的重要家族成員[11]。JNK 蛋白激酶由由三種蛋白激酶基因編碼[12]，其中JNK1-3 通過磷酸化激活后，不同JNK 異構(gòu)體通過特定模式與特定的蛋白底物激活、結(jié)合及進行磷酸化[13]。JNK 分別由JNK 激酶1、2 激活，并從細胞質(zhì)向細胞核轉(zhuǎn)移，進而與細胞核內(nèi)的ATF2 和c-Jun 尾端的63、73 位絲氨酸結(jié)合，引導相關(guān)基因與蛋白的表達，廣泛參與體內(nèi)的炎癥及免疫反應(yīng)[14]。

目前研究JNK 信號及OSA 相互關(guān)系的實驗不多，已有資料顯示在大腦海馬區(qū)的損傷中二者關(guān)系密切。相關(guān)研究表明[15]，大鼠在間歇性缺氧環(huán)境下海馬區(qū)的JNK 磷酸化水平上升，誘導細胞的凋亡，進而對機體的學習記憶功能產(chǎn)生影響。丙二醛（malondialdehyde，MDA）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是氧化應(yīng)激的主要標志物[16]。間歇性低氧使機體MDA 表達水平上升及SOD 表達水平下降，同時導致JNK 表達水平上升，證實間歇性低氧會引導氧化應(yīng)激反應(yīng)的出現(xiàn)，進而上調(diào)JNK 基因及相關(guān)蛋白表達，對大鼠神經(jīng)系統(tǒng)造成損害并破壞記憶功能[17]。另外，隨著間歇性低氧持續(xù)時間增加，大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)亦隨之增強，體內(nèi)組織的相關(guān)JNK 基因及蛋白表達水平隨之上升，由此推斷JNK信號通路參與了OSA 患者炎癥反應(yīng)，并與炎癥反應(yīng)的發(fā)展密切相關(guān)。

當前有關(guān)JNK 信號通路作用于血管重構(gòu)的研究較少。已有研究表明，血管重構(gòu)與VSMCs 的表型轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，VSMCs 作為動脈中膜的主要細胞成分，可以根據(jù)生理形態(tài)及功能的不同，分為收縮型和合成型[18]。當受到免疫炎癥反應(yīng)刺激后，VSMCs 發(fā)生轉(zhuǎn)化，其表達形式發(fā)生轉(zhuǎn)變，由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，進而介導VSMCs 增殖和轉(zhuǎn)移，細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成增加，最終導致血管重構(gòu)，這也是高血壓的重要病理特征之一[19，20]。因此，JNK 信號通路作為的炎癥反應(yīng)信號通路，其可能參與了腹主動脈中VSMCs 的表型轉(zhuǎn)化，進而介導血管重構(gòu)的產(chǎn)生。

本研究結(jié)果顯示，與常氧對照組大鼠比較，間歇性低氧組大鼠MAP 升高，而間歇性低氧干預(yù)組大鼠MAP 較間歇性低氧組大鼠下降，且與常氧干預(yù)組MAP 水平比較無差異，說明JNK 信號通路調(diào)控OSA 高血壓的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，間歇性低氧組大鼠腹主動脈出現(xiàn)血管壁炎性細胞浸潤、彈性纖維損害、平滑肌細胞丟失及內(nèi)膜厚度增加等血管重構(gòu)現(xiàn)象，而間歇性低氧干預(yù)組中腹主動脈血管重構(gòu)現(xiàn)象不明顯，說明JNK 信號通路參與OSA 合并高血壓大鼠的腹主動脈血管重構(gòu)過程。另外，Western blot及RT-PCR 結(jié)果顯示，間歇性低氧組大鼠腹主動脈組織中JNK mRNA 及JNK 相關(guān)蛋白的表達水平較常氧對照組增高，但與間歇性低氧干預(yù)組大鼠對比，JNK mRNA 及JNK 相關(guān)蛋白的表達水平下降，這進一步提示JNK 信號通路參與了OSA 合并高血壓大鼠的血管重構(gòu)現(xiàn)象，結(jié)合間歇性低氧組大鼠的血管重構(gòu)現(xiàn)象，進一步說明了JNK 信號通路通過調(diào)節(jié)JNK mRNA 及JNK 相關(guān)蛋白的表達水平，影響腹主動脈血管重構(gòu)，進而調(diào)控OSA 合并高血壓大鼠的血管重構(gòu)情況。因此，抑制JNK 信號通路可以抑制腹主動脈血管重構(gòu)，進而抑制高血壓的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，間歇性低氧會激活JNK 信號通路，上調(diào)JNK 信號通路的mRNA 及蛋白表達水平，引起高血壓，并介導大鼠腹主動脈出現(xiàn)的血管重構(gòu)。阻斷JNK 信號通路能抑制OSA 所致的血壓升高及血管重構(gòu)現(xiàn)象，這可能成為治療阻塞性睡眠呼吸暫停合并高血壓的新思路。