反相HPLC法測定雷公藤內(nèi)酯醇的含量和有關(guān)物質(zhì)

摘要 目的：建立反相高效液相色譜法，測定雷公藤內(nèi)酯醇的含量和有關(guān)物質(zhì)。方法：采用Discovery SUPELCO C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水為流動(dòng)相，含量等度洗脫測定、有關(guān)物質(zhì)梯度洗脫測定，檢測波長219 nm，柱溫25 ℃。結(jié)果：雷公藤內(nèi)酯醇含量測定方法中，樣品溶液在8～48 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2= 1.000 0），平均回收率為99.48%，RSD為0.59%，溶液穩(wěn)定性好。結(jié)論：方法快速、準(zhǔn)確，專屬性好，靈敏度符合測定要求。

關(guān)鍵詞 雷公藤內(nèi)酯醇 雷公藤內(nèi)酯酮 梯度洗脫 高效液相色譜

中圖分類號(hào)：O657.72； R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2012）21-0049-04

雷公藤內(nèi)酯醇是第一個(gè)被確認(rèn)具有松香烷結(jié)構(gòu)的二萜類三環(huán)氧內(nèi)酯化合物。自1936年以來從雷公藤中已分離出多種有效成分，主要是生物堿類、二萜類、三萜類、倍半萜類及多糖，其中二萜類物質(zhì)雷公藤內(nèi)酯醇為主要有效藥理成分，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等多種生物活性[1]；此外，雷公藤內(nèi)酯醇能誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡，抑制多種在自身免疫系統(tǒng)疾病和排異反應(yīng)中起重要作用的前致炎細(xì)胞因子的表達(dá)[2]。目前本品標(biāo)準(zhǔn)尚未收錄于中國藥典，文獻(xiàn)資料多報(bào)道雷公藤藥材或制劑中雷公藤內(nèi)酯醇提取物的含量測定[3，4]。本文根據(jù)樣品來源特點(diǎn)及質(zhì)量控制關(guān)鍵點(diǎn)，針對雷公藤內(nèi)酯醇試制品及其主要雜質(zhì)內(nèi)酯酮的質(zhì)量監(jiān)測，采用乙腈-水為流動(dòng)相體系[5]，研究并建立高效液相色譜方法，可快速、準(zhǔn)確測定雷公藤內(nèi)酯醇的含量和有關(guān)雜質(zhì)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100液相色譜儀，DAD檢測器。色譜柱為Discovery SUPELCO C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）。雷公藤內(nèi)酯醇試制品：上海皓元化學(xué)科技有限公司（批號(hào)：20070430、20070604、20070911、20071025）；雷公藤內(nèi)酯醇標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所（批號(hào)：111567-200502，20 mg/支）；乙腈：色譜純（Fisher試劑）；水：純化水（密理博純水儀制備）。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果[6]

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性

流動(dòng)相：乙腈-水（24∶76）；流速：1 ml/min；檢測波長：219 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。理論板數(shù)按雷公藤內(nèi)酯醇峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000，雷公藤內(nèi)酯醇和雷公藤內(nèi)酯酮峰的分離度應(yīng)大于1.5。

2.1.2 線性關(guān)系

2.1.3 精密度試驗(yàn)（重復(fù)性）

2.1.4 穩(wěn)定性測定

2.1.5 回收率試驗(yàn)

2.1.6 定量限

2.2 有關(guān)物質(zhì)檢測方法

2.2.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性

2.2.2 專屬性考察

2.2.3 靈敏度試驗(yàn)

取2.1.2項(xiàng)下濃度8 μg/ml的溶液，再等比稀釋成一系列濃度的溶液，取10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算信噪比。當(dāng)濃度為0.04 μg/ml時(shí)，其S/N≈3，最小檢測限為0.4 ng，靈敏度符合測定要求。

2.3 三批樣品測定結(jié)果

3 討論

雷公藤內(nèi)酯醇不溶于水，溶于二甲亞砜、甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑，并在這些溶劑中穩(wěn)定，在配制溶液時(shí)應(yīng)先用適量乙腈溶解，再用流動(dòng)相稀釋。在預(yù)試驗(yàn)時(shí)考察甲醇-水、乙腈-水不同流動(dòng)相體系，結(jié)果表明以乙腈-水為流動(dòng)相系統(tǒng)梯度洗脫時(shí)，待測組分雷公藤內(nèi)酯醇、內(nèi)酯酮與其它組分能有效分離，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，峰形更好。另外，將雷公藤內(nèi)酯醇和內(nèi)酯酮的混合對照品在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，最大吸收波長為219 nm，故最終選擇乙腈-水作為流動(dòng)相梯度洗脫，219 nm作為檢測波長。

本研究用的雷公藤內(nèi)酯醇試制品是從天然植物雷公藤根皮或葉子中提取得到的，工藝過程是以醇水浸提植物、濃縮、水洗、氯仿提取、過柱、丙酮重結(jié)晶等流程得到的。本研究目的是建立一種適應(yīng)樣品來源的HPLC分析方法，作為一種定量分析方法，重復(fù)性好（RSD<0.2%）、線性關(guān)系良好（R2=1.000）及準(zhǔn)確性高。有關(guān)物質(zhì)的分析方法為梯度洗脫，具有較高的專屬性，尤其是對其中的雷公藤內(nèi)酯酮的控制，為雷公藤內(nèi)酯醇試制品的質(zhì)量控制提供了快速、準(zhǔn)確的方法。

此外，該試制品是我公司一類新藥雷騰舒的起始原料，其品質(zhì)將直接影響成品的質(zhì)量情況和穩(wěn)定性，因此建立穩(wěn)定、可靠的質(zhì)量控制指標(biāo)，從源頭把好質(zhì)量關(guān)，非常重要。本研究針對雷公藤內(nèi)酯醇含量、有關(guān)物質(zhì)這兩個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量項(xiàng)，建立了方法，并通過詳細(xì)的驗(yàn)證確保方法的準(zhǔn)確、可靠和可重復(fù)，為成品的質(zhì)量提供了良好的保障。

參考文獻(xiàn)

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[3] 張志勇， 陳潔， 程艷霞， 等. 高效液相色譜法測定海棠合劑中雷公藤內(nèi)酯醇含量[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志， 2005， 25（2）： 120-121.

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[5] 褚克丹， 李煌， 徐偉， 等. HPLC法測定雷公藤內(nèi)酯醇和內(nèi)酯酮的含量[J]. 福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 21（5）： 27-29.

[6] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典2010年版（二部）[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010： 194-195， ⅩⅨA.

（收稿日期：2012-07-03）