細(xì)針吸取細(xì)胞學(xué)結(jié)合PCR法在淋巴結(jié)結(jié)核診斷中的應(yīng)用及其與傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法的比較

[摘要] 目的 研究對(duì)比162例淋巴結(jié)結(jié)核的診斷方法。 方法 選取浙江省金華市中心醫(yī)院于2008年1月～2010年6月經(jīng)細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)診斷淋巴結(jié)結(jié)核或可疑結(jié)核的病例，穿刺組織同時(shí)進(jìn)行抗酸染色、細(xì)菌培養(yǎng)及PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA（TB—DNA）。 結(jié)果 TB—DNA陽(yáng)性117例，陽(yáng)性率為72.2%；抗酸染色陽(yáng)性71例，陽(yáng)性率為43.8%；細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性99例，陽(yáng)性率為61.1%；在61例FNAC直接診斷結(jié)核的病例，PCR及細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率明顯高于抗酸染色（χ2值均為13.739，P < 0.01），在101例FNAC診斷為可疑結(jié)核或不排除結(jié)核的病例，PCR陽(yáng)性率高于細(xì)菌培養(yǎng)及抗酸染色（χ2值分別為6.706、13.612，P均<0.01）；抗酸染色及細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性的病例TB—DNA均陽(yáng)性； FNAC結(jié)合PCR結(jié)果可明確診斷80.9%結(jié)核。 結(jié)論 FNAC是診斷淋巴結(jié)結(jié)核簡(jiǎn)便有效的方法， PCR擴(kuò)增高效、快速、敏感、特異，可作為FNAC診斷結(jié)核很好的補(bǔ)充，F(xiàn)NAC結(jié)合PCR技術(shù)是較好的淋巴結(jié)結(jié)核的診斷方法。

[關(guān)鍵詞] 細(xì)針穿刺；細(xì)胞學(xué)；聚合酶鏈反應(yīng)；結(jié)核；淋巴結(jié)

[中圖分類號(hào)] R522 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673—9701（2012）26—0021—03

Comparative evaluation of the diagnostic method in 162 cases of tuberculous lymphadenitis

WANG Lixia1 ZHU Fang1 SHEN Wei2 ZHU Yijun3

1.Department of Pathology， Jinhua Central Hospital in Zhejiang Province， Jinhua 321000， China；2.Department of Hepatobiliary Surgery， Jinhua Central Hospital in Zhejiang Province， Jinhua 321000， China；3.Department of Laboratory， Jinhua Central Hospital in Zhejiang Province， Jinhua 321000， China

[Abstract] Objective To evaluate the diagnostic method in 162 cases of tuberculous lymphadenitis. Methods A—total of 162 cases of tuberculous lymphadenitis were performed by fine needle aspiration cytology（FNAC），as well as acid—fast bacillus stain（AFB）， culture and PCR； Results Among the 162 cases， 117 cases were TB—DNA positive（117/162，72.2%）， while the positivity of AFB was 43.8% （71/162），and culture was 61.1%（99/162）； In 61 definitely diagnosed tuberculous lymphadenitis by FNAC cases， the positive rate of PCR and of culture were significantly higher than which of AFB （P < 0.01）， and in 101 cases which diagnosed suspiciously， the positive rate of PCR was higher than which of AFB and culture （P < 0.01）.The positive cases of AFB and culture were all TB—DNA positive； FNAC combined with PCR can diagnose 80.9% tuberculous lymphadenitis clearly. Conclusion FNAC combined with PCR to test TB—DNA is the most simple and effective diagnostic method of tuberculous lymphadenitis.

[Key words] Fine needle aspiration；Cytology；Polymerase chain reaction；Tuberculosis；Lymph node

結(jié)核病可通過(guò)空氣經(jīng)呼吸道傳播，目前全球結(jié)核病疫情仍相當(dāng)嚴(yán)峻[1]。我國(guó)為世界第二大“結(jié)核國(guó)”，僅次于印度。近年來(lái)肺外結(jié)核病的發(fā)病率呈明顯上升且持續(xù)上升趨勢(shì)，主要又以淺表淋巴結(jié)結(jié)核為首，因此探索一種簡(jiǎn)便有效的淋巴結(jié)結(jié)核的確診方法是迫切而首要的任務(wù)。現(xiàn)將我院于2008年1月～2010年6月診斷為淋巴結(jié)結(jié)核的162例病例情況總結(jié)分析，探討各診斷方法的優(yōu)越性及局限性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 收集浙江省金華市中心醫(yī)院2008年1月～2010年6月診斷為淋巴結(jié)結(jié)核的162例病例材料。臨床表現(xiàn)為淺表淋巴結(jié)腫大，其中男67例，女95例，年齡2～89歲，平均38.2歲，中位年齡42歲。腫塊部位為頸部者88例，其余鎖骨上36例，腋下11例，頜下13例，胸壁6例，腹股溝5例，腰背部2例，臀部1例。詳細(xì)詢問(wèn)病史，23例曾有結(jié)核病史，正在服用抗結(jié)核藥物或曾經(jīng)服用抗結(jié)核藥物，4例于當(dāng)?shù)匦l(wèi)生院頸部腫塊切除，術(shù)后腫塊復(fù)發(fā)并紅腫，硬結(jié)，化膿。所有病例電話隨訪6個(gè)月以上，56例進(jìn)行結(jié)核菌素（PPD）試驗(yàn)陽(yáng)性；44例胸片顯示肺部結(jié)核病灶；87例正規(guī)抗結(jié)核治療并顯效（腫塊縮小、消失）。

1.1.2 儀器與試劑 LightCycler PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)羅氏公司產(chǎn)品；PCR試劑為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司產(chǎn)品；抗酸染色液為珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集 腫塊局部皮膚常規(guī)消毒，采用10 mL一次性注射器（針頭22G），左手固定腫塊，右手保持負(fù)壓在腫塊內(nèi)反復(fù)多方向提插數(shù)次，去負(fù)壓，分離針頭針筒，拔出針頭，將吸出物打在載玻片上，涂片24張，一張稍干燥用于抗酸染色，其余立即用95%乙醇固定，然后HE染色鏡檢。用細(xì)胞學(xué)剩余材料或重新穿刺材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增及結(jié)核桿菌培養(yǎng)

1.2.2 PCR法檢測(cè)TB—DNA 將穿刺標(biāo)本用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，取50 μL沉渣懸液加50 μL lDNA提取液充分混勻，置100℃沸水浴中10 min，取出后置4℃，6～8 h以保證充分裂解。10000 rpm離心5 min，取上清液2 μL加入專用毛細(xì)管中，4000 rpm離心3 min，插入圓形卡盤(pán)倒置20 s后放入儀器中設(shè)置循環(huán)條件為93℃，2 min預(yù)變性，然后經(jīng)93℃，5 s；57℃，45 s，共40個(gè)循環(huán)，37℃延伸1 min。另取陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品各40μL加等量DNA提取液打勻，沸水浴10min后同上處理。反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件，調(diào)整熒光記數(shù)值為F1/F2，點(diǎn)擊Quantification讀取結(jié)果。以Ct（Cycle threshold）值判斷結(jié)果，Ct值<40為陽(yáng)性，Ct值≥40為陰性。

1.2.3 抗酸染色法找抗酸桿菌 按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。主要步驟如下：（1）初染：涂片上滴加石碳酸復(fù)紅液，用火焰加熱至產(chǎn)生蒸汽，約5 min（防止染液蒸干），水洗。（2）脫色：第二液（3%鹽酸乙醇）脫色約1 min，輕輕搖動(dòng)玻片至涂片無(wú)紅色脫出或略顯粉紅色時(shí)為止，水洗。（3）復(fù)染：第三液（呂氏美藍(lán)復(fù)染液）復(fù)染30 s，水洗。自然干燥后鏡檢。抗酸桿菌染成紅色，非抗酸桿菌為藍(lán)色。

1.2.4 結(jié)核桿菌細(xì)菌培養(yǎng) （1）前處理：視標(biāo)本性狀，加1～2倍體積4%氫氧化鈉（NaOH）消化液于標(biāo)本瓶中，渦旋振蕩器振蕩2～3 min，使標(biāo)本充分勻化，室溫放置。（2）接種：吸取經(jīng)前處理后的標(biāo)本0.1 mL，均勻接種在整個(gè)培養(yǎng)基斜面。每份標(biāo)本接種兩支酸性羅氏培養(yǎng)基。接種后，37℃平臥放置斜面24 h。然后擰緊培養(yǎng)瓶蓋或塞緊試管膠塞，直立放置，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。（3）結(jié)果與報(bào)告：接種后第3天、第7天各觀察1次。3 d發(fā)現(xiàn)菌落生長(zhǎng)者，經(jīng)抗酸染色證實(shí)后，可報(bào)告快速生長(zhǎng)抗酸桿菌。以后每周觀察1次，記錄菌落生長(zhǎng)及污染情況。陽(yáng)性生長(zhǎng)物經(jīng)抗酸染色證實(shí)后，可報(bào)告抗酸桿菌生長(zhǎng)。培養(yǎng)陰性結(jié)果須在滿8周時(shí)即第9周開(kāi)始時(shí)仍未見(jiàn)菌落者方可報(bào)告。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。不同檢測(cè)方法陽(yáng)性率的比較采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)（（Fine needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC）診斷結(jié)核的主要依據(jù)是涂片中找到干酪樣壞死物、朗罕細(xì)胞和類上皮細(xì)胞，若三者同時(shí)見(jiàn)于淋巴結(jié)穿刺涂片，即可診斷淋巴結(jié)結(jié)核[2]。本組162例，F(xiàn)NAC直接診斷淋巴結(jié)結(jié)核61例，占37.7%，其它101例可見(jiàn)肉芽腫性病變或壞死性病變，診斷為可疑結(jié)核或不排除結(jié)核，進(jìn)一步病原學(xué)檢查陽(yáng)性和/（或）伴有肺部病灶、PPD實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性及抗結(jié)核治療有效。

162例穿刺涂片抗酸染色，涂片通過(guò)1000倍油鏡仔細(xì)查找，發(fā)現(xiàn)染成紫紅色棒狀，彎曲桿狀細(xì)菌為陽(yáng)性，見(jiàn)圖3，抗酸桿菌可散在數(shù)條或小簇散布。162例抗酸染色陽(yáng)性71例，陽(yáng)性率43.8%。穿刺物PCR擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌TB—DNA，電腦自動(dòng)判讀結(jié)果，陽(yáng)性病例可見(jiàn)擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖4，TB—DNA陽(yáng)性117例，陽(yáng)性率為72.2%。結(jié)核桿菌培養(yǎng)需特殊培養(yǎng)基，菌落生長(zhǎng)似奶酪，見(jiàn)圖5。細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性99例，陽(yáng)性率為61.1%。各項(xiàng)病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果與FNAC診斷結(jié)果的對(duì)比見(jiàn)表1。

表1 162例結(jié)核FNAC診斷與抗酸染色、細(xì)菌培養(yǎng)、PCR檢測(cè)結(jié)果的比較

可見(jiàn)在FNAC明確診斷的病例，PCR及細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率明顯高于抗酸染色（χ2值均為13.739，P < 0.01），在101例FNAC未直接診斷結(jié)核的病例，PCR陽(yáng)性率高于細(xì)菌培養(yǎng)及抗酸染色（χ2值分別為6.706、13.612，P均<0.01）。另外71例涂片找到抗酸桿菌的病例細(xì)菌培養(yǎng)及PCR結(jié)果均陽(yáng)性，而99例細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性的病例TB—DNA均陽(yáng)性。FNAC直接診斷淋巴結(jié)結(jié)核的61例，占37.7%，F(xiàn)NAC結(jié)合PCR結(jié)果可明確診斷結(jié)核的為131例，占80.9%。

根據(jù)FNAC鏡下所見(jiàn)可分為增殖型：呈肉芽腫樣改變，可見(jiàn)小巢和散在杵狀、黃瓜狀上皮樣細(xì)胞和/（或）郎罕細(xì)胞（圖1）。有反應(yīng)性淋巴細(xì)胞，未見(jiàn)干酪樣壞死組織；增殖伴壞死型：在增殖型涂片基礎(chǔ)上可見(jiàn)不同數(shù)量淡染嗜伊紅的無(wú)定形物質(zhì)；干酪樣壞死型：見(jiàn)大量淡染嗜伊紅的壞死組織或水樣壞死無(wú)定形物（圖2）。背景中可見(jiàn)殘存的淋巴細(xì)胞，伴發(fā)感染時(shí)可見(jiàn)多量中性粒細(xì)胞。其各項(xiàng)病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可見(jiàn)抗酸染色，細(xì)菌培養(yǎng)及PCR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率在沒(méi)有壞死的增殖型明顯低于壞死型及伴有壞死的增殖型（χ2值分別為6.786，13.183，13.739，P均 < 0.01），而三者陽(yáng)性率在增殖壞死型及干酪樣壞死型間無(wú)明顯差異（χ2值分別為2.973，2.981，3.001，P均>0.05）。

表2 FNAC分型與抗酸染色、細(xì)菌培養(yǎng)、PCR檢測(cè)結(jié)果的關(guān)系[n（%）]

3 討論

由于人類艾滋病病毒和耐藥結(jié)核菌株的產(chǎn)生等原因，全球結(jié)核病疫情明顯上升并呈持續(xù)上升趨勢(shì)[3]。世界衛(wèi)生組織于2006年發(fā)起防治結(jié)核病全球計(jì)劃。我們的實(shí)驗(yàn)旨在探索一種簡(jiǎn)便有效的淋巴結(jié)結(jié)核的確診方法。

細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)（FNAC）是近年發(fā)展迅速的一種簡(jiǎn)便、安全、快速的診斷方法，克服了外科取活檢組織損傷大，傷口不易愈合，還可能形成竇道，瘺等后遺癥的缺點(diǎn)。Balaji等[4]認(rèn)為FNAC診斷淋巴結(jié)結(jié)核的準(zhǔn)確性接近活檢。我們的數(shù)據(jù)顯示，162例淋巴結(jié)結(jié)核通過(guò)FNAC能直接確診的為61例，其余101例診斷為可疑結(jié)核或不排除結(jié)核，一般情況下需進(jìn)一步提供病原性依據(jù)，才可進(jìn)行正規(guī)抗結(jié)核治療。我們的結(jié)果還顯示，在FNAC明確診斷的病例，PCR及細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率明顯高于抗酸染色（χ2均為13.739，P < 0.01），在FNAC未直接診斷結(jié)核的病例，PCR陽(yáng)性率高于細(xì)菌培養(yǎng)及抗酸染色（χ2分別為6.706、13.612，P均 < 0.01 ）。另外抗酸染色及細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性的病例TB—DNA均陽(yáng)性，只要FNAC結(jié)合PCR可明確診斷80.9%結(jié)核，這與相關(guān)報(bào)道一致。

Honore—Bouakline等[5]認(rèn)為肺外結(jié)核細(xì)菌含量通常較少，抗酸染色和細(xì)菌培養(yǎng)假陰性較高。Tiwari等[6]發(fā)現(xiàn)送檢材料細(xì)菌含量在（10000～100000）/mL時(shí)，涂片上才能檢到細(xì)菌。文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)針穿刺涂片抗酸桿菌檢出率在0～77.8%，我們的結(jié)果與Mirza等[7]的42%接近。細(xì)菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率也報(bào)道不一，Pahwa等[8]的結(jié)果僅為22%，我們的結(jié)果與Mittal等[9]的60%接近。因?yàn)榫酆厦告湻磻?yīng)（PCR）檢測(cè)的是結(jié)核分枝桿菌染色體特異的DNA片段，不受各種分枝桿菌菌種的影響，它可在短時(shí)間內(nèi)將極微量靶DNA特異地?cái)U(kuò)增百萬(wàn)倍以上，大大提高對(duì)DNA的檢出能力，所以即使18例培養(yǎng)陰性的病例PCR結(jié)果仍陽(yáng)性，并且抗酸染色和培養(yǎng)陽(yáng)性的病例PCR無(wú)一陰性，可見(jiàn)PCR結(jié)果的高效性和敏感性。本組數(shù)據(jù)仍有44例PCR結(jié)果陰性，分析可能的原因?yàn)楸窘M病例有23例服用或服用過(guò)抗結(jié)核藥物，細(xì)菌大部分已消滅，另外穿刺時(shí)出血明顯或穿刺物位于壞死中心部位可干擾DNA的提取以及增殖型病例細(xì)菌被殺滅等。

我們的結(jié)果還顯示，抗酸染色、細(xì)菌培養(yǎng)及PCR結(jié)果均與FNAC的分型相關(guān)， 17例增殖型僅有2例PCR結(jié)果陽(yáng)性，抗酸染色和細(xì)菌培養(yǎng)無(wú)一例陽(yáng)性，這與該型細(xì)菌量少、毒力低而人體免疫力強(qiáng)，細(xì)菌在結(jié)核結(jié)節(jié)形成過(guò)程中被清除有關(guān)，與結(jié)核病的基本病理變化相吻合。

相關(guān)報(bào)道對(duì)淋巴結(jié)結(jié)核的診斷方法已做比較[1，9—11]。我們認(rèn)為FNAC是診斷淋巴結(jié)結(jié)核安全有效的方法，同時(shí)還為生物學(xué)材料的獲取提供一種簡(jiǎn)便途徑；涂片抗酸染色是廉價(jià)簡(jiǎn)便的方法，但敏感性稍低；細(xì)菌培養(yǎng)曾被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，假陰性率仍較高； PCR擴(kuò)增高效、快速、敏感、特異，可作為FNAC診斷結(jié)核很好的補(bǔ)充。

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（收稿日期：2012—05—24）