Notch1在調(diào)節(jié)小細(xì)胞肺癌多藥耐藥中的作用

[摘要] 目的 探討Notch1在小細(xì)胞肺癌多藥耐藥中的作用。 方法 首先通過QRT—PCR和Western—blot從基因和蛋白水平檢測(cè)小細(xì)胞肺癌敏感細(xì)胞株（H69）和耐藥細(xì)胞株（H69AR）中Notch1的差異表達(dá)；應(yīng)用siRNA抑制耐藥細(xì)胞株H69AR中的Notch1的表達(dá)，通過CCK8檢測(cè)細(xì)胞對(duì)各種化療（ADM，DDP，VP—16）的敏感性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化。 結(jié)果 Notch1在H69AR中的表達(dá)明顯高于H69，抑制耐藥細(xì)胞株中Notch1的表達(dá)能夠增加細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。 結(jié)論 Notch1可能參與了調(diào)節(jié)小細(xì)胞肺癌對(duì)多藥耐藥性。

[關(guān)鍵詞] Notch1；多藥耐藥；小細(xì)胞肺癌

[中圖分類號(hào)] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673—9701（2012）26—0006—03

The role of Notch1 on regulating multi—drug resistance in small cell lung cancer

FENG Liping SU Wenmei

The Third Branch of Cancer Center，the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524000，China

[Abstract] Objective To investigate the role of Notch1 on regulates multi—drug resistance in small cell lung cancer. Methods Detected by Western blotting and real—time PCR（RT—PCR）， differential expression of Notch1 gene and protein in both the drug— sensitive cell line H69 and ADM—resistant cell line H69AR. The Notch1 expression was blocked by the SiRNA in H69AR.Then the sensitivities of cells to chemotherapy drugs such as ADM， DDP， VP—16 were detected by CCK8 assay， apoptosis rate by flow cytometry. Results The expression of Notch1 was significantly increased in H69AR cells than in the H69 cells. The sensitivities of H69AR cells to chemotherapy drugs were increased when down—regulated the expression of the Notch1，with the apoptosis were increased. Conclusion Notch1 may associate with chemotherapy resistance of small cell lung cancer.

[Key words] Notch1；Multidrug resistance；Small cell lung cancer

最新統(tǒng)計(jì)資料顯示肺癌已成為當(dāng)今世界第一高發(fā)癌，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，小細(xì)胞肺癌（SCLC）的發(fā)病率約占原發(fā)性肺癌的15%～20%[1]。由于SCLC具早期發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的傾向，因此全身化療為其治療重點(diǎn)，雖然SCLC患者對(duì)化療敏感，但極易產(chǎn)生抗藥性而導(dǎo)致化療失敗，臨床預(yù)后差[2，3]。因此，化療抗藥性已成為目前小細(xì)胞肺癌臨床治療急需解決的問題之一。Notch1屬于Notch跨膜受體家族，參與介導(dǎo)多種細(xì)胞的凋亡、增殖和細(xì)胞分化多效性作用，最近研究結(jié)果顯示Notch1具有促癌和抑癌雙重作用，其信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展成為目前研究熱點(diǎn)[4]。我們前期通過基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Notch1在H69AR中的表達(dá)較H69明顯增高，本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步驗(yàn)證Notch1在小細(xì)胞肺癌敏感細(xì)胞株H69和其阿霉素耐藥株H69AR中的表達(dá)，以及其表達(dá)對(duì)小細(xì)胞肺癌化療藥物耐藥性及細(xì)胞凋亡的影響。

1材料與方法

1.1 材料

人小細(xì)胞肺癌敏感細(xì)胞株（H69）及其阿霉素耐藥株（H69AR）均購(gòu)自美國(guó)ATCC， 新生胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；順鉑、阿霉素和依托泊苷購(gòu)自輝瑞公司；CCK8及凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司第1鏈cDNA合成試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒購(gòu)自大連寶生生物公司；兔抗人單克隆抗體Notch1購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德生物公司。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析EAG1的mRNA表達(dá)

提取細(xì)胞中的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。Notch1上游引物為5’—CGCCAGAGTGGACAGGTCAGTA—3’，下游引物為5’— GCAGTTGGAGCCCTCGTTA—3’；內(nèi)參照GAPDH上游引物為5’—GGAAGGACTCATGACCACAGTCC—3’，下游引物為5’—TCGCTGTI'GAAGTCAGAGGAGACC—3’ 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及PCR參照試劑盒說明，以Nocth1基因的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2—△△Ct的方法進(jìn)行分析。

1.3 SiRNA下調(diào)Notch1的表達(dá)

將合成的SiRNA轉(zhuǎn)染入H69AR細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前 24 h將細(xì)胞按5×105個(gè)/mL密度接種于6孔板，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度為70%左右，將500 μL Opti—MEM或者無血清培養(yǎng)基稀釋 3 μL LipofectamineTM 2000，輕輕吹吸 3～5 次混勻，室溫下靜置 5 min；將3 μL干擾片段稀釋于500 μL Opti—MEM或者無血清培養(yǎng)基中，輕輕吹吸3～5次混勻；混合轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒稀釋液，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫下靜置 20 min；轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到 6孔細(xì)胞板中，1mL/孔，前后輕搖細(xì)胞板混合均勻。細(xì)胞板置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4～6 hrs 后換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24 h檢測(cè)基因表達(dá)的變化，48 h后檢測(cè)蛋白的表達(dá)。

1.4 Western blotting分析Notch1蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量，每孔中加樣50 μg蛋白，經(jīng)8%SDS—PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%BSA/TBST室溫封閉1 h，加入兔抗人Notch1單克?。?：200）孵育，4℃過夜。TBST漂洗三次，用 HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1：5000）孵育，室溫2 h，TBST漂洗三次，ECL檢測(cè)，暗室曝光10 s～10 min，顯影。

1.5 CCK8法檢測(cè)藥物敏感性

參照順鉑（DDP）、足葉乙甙（VP—16）及阿霉素（DOX）3 種化療藥物的血漿高峰濃度，在各種轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分別加入 0.01 倍、0.1 倍、1 倍和 10 倍血漿高峰濃度的化療藥物，每種藥物的每一濃度設(shè) 4 個(gè)重復(fù)孔；陰性對(duì)照組：僅加細(xì)胞不加藥物，設(shè) 4 個(gè)重復(fù)孔；空白調(diào)零組：僅加細(xì)胞培養(yǎng)液，設(shè)4個(gè)重復(fù)孔。以每孔 3×103個(gè)細(xì)胞接種于 96 孔培養(yǎng)板中，每孔加入200 μL培養(yǎng)液；細(xì)胞貼壁后，將3種化療藥物按不同濃度加入各孔細(xì)胞，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng) 24 h；每孔加新鮮配制的CCK8溶液20 μL，37℃、5%CO2下繼續(xù)培養(yǎng)0.5～4 h 后，終止培養(yǎng)。選擇 450 nm 波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，取每 4 個(gè)重復(fù)孔的光吸收值（A 值）的平均值，計(jì)算各種轉(zhuǎn)染細(xì)胞在3 種化療藥物不同濃度下的存活率；細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組 A 值—空白對(duì)照組 A 值）/（陰性對(duì)照組 A 值—空白對(duì)照組 A 值）×100%。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，取平均值，以細(xì)胞存活率為縱軸，藥物濃度對(duì)數(shù)為橫軸作半對(duì)數(shù)圖，并按作圖法求出 3 種藥物的 IC50 值。

1.6細(xì)胞凋亡檢測(cè)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞及原代細(xì)胞H9C2 以 4×105/孔接種于6 孔板中；37℃培養(yǎng) 48 h；收集細(xì)胞，PBS 洗滌 2 次；細(xì)胞重懸于 100 μL 含 Annexin V—FITC 和 0.5 μg PI 的結(jié)合緩沖液（10 mM HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，5 mM KCl，1mM MgCl2， 1.8 mM CaCl2）中；光室溫孵育15 min；加入400 μL 結(jié)合緩沖液；流式細(xì)胞儀分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)或One—way ANOVA檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 Notch1在敏感株（H69）和耐藥株（H69AR）中的表達(dá)

如圖1A所示，QRT—PCR結(jié)果顯示H69AR細(xì)胞株中Notch1的mRNA表達(dá)較H69細(xì)胞明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.003）。Western blot結(jié)果也顯示在耐藥株H69AR中的Notch1蛋白的表達(dá)較敏感株H69顯著升高（見圖1B，P = 0.000）。

2.2 通過SiRNA下調(diào)H69AR細(xì)胞株中Notch1的表達(dá)

如圖2所示，H69AR細(xì)胞轉(zhuǎn)染Notch1的小干擾RNA后，Notch1在 mRNA和蛋白水平上均明顯降低（P = 0.004），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3細(xì)胞藥物敏感性的變化

CCK8檢測(cè)示H69AR對(duì)順鉑（DDP），阿霉素（ADM）及依托泊苷（VP—16）的敏感性較H69明顯降低（圖3A，P = 0.009）。應(yīng)用小干擾RNA在H69AR細(xì)胞株中下調(diào)Notch1的表達(dá)后，與對(duì)照組相比細(xì)胞對(duì)DDP，ADM及VP—16的敏感性明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3B，P = 0.02）。

圖3 細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的檢測(cè)，A：cck8檢測(cè)H69和H69AR細(xì)胞對(duì)化療藥物DDP，ADM及VP—16的敏感性；B：通過小干擾RNA下調(diào)H69AR中Notch1的表達(dá)后，細(xì)胞對(duì)DDP，ADM及VP—16的敏感性明顯增加（**P < 0.01，*P < 0.05）；DDP：順鉑；ADM：阿霉素；VP—16：依托泊苷

2.4 細(xì)胞凋亡率的變化

流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)顯示，H69組凋亡率為（22.94±0.74）%，H69AR細(xì)胞凋亡率為（9.13±0.1）%（P < 0.01），兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而H69AR—Si—Notch1組凋亡率為（18.104±0.198）%（P < 0.01），下調(diào)Notch1明顯促進(jìn)H69AR細(xì)胞凋亡。

3 討論

Notch基因發(fā)現(xiàn)于1919年，其突變可造成果蠅的殘翅，隨后發(fā)現(xiàn)其家族成員的結(jié)構(gòu)具有高度保守性，在細(xì)胞分化、發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。目前在人體細(xì)胞中共發(fā)現(xiàn)了4個(gè)Notch同源體，包括Notch1、Notch2、Notch3、Notch4。Notch1基因編碼的單鏈跨膜糖蛋白，是保守的細(xì)胞膜表面受體，配體與Notch1受體胞外區(qū)表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)序列（EGF—Like repeat）結(jié)合后構(gòu)象的改變激活了金屬蛋白酶家族的TNFa轉(zhuǎn)化酶（TA—CE）和促分泌酶（Secretasc）分別對(duì)胞外S2位點(diǎn)和跨膜S3位點(diǎn)剪切，膜上釋放Notch1的胞內(nèi)區(qū)（NICD）轉(zhuǎn)移人核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控下游基因的表達(dá)或通過復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮效應(yīng)。Notch1與腫瘤的關(guān)系復(fù)雜，目前存在爭(zhēng)論，一方面Notch1抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，參與調(diào)解腫瘤的多藥耐藥，如可抑制Hela細(xì)胞p27 Kip1的表達(dá)，進(jìn)而減少細(xì)胞周期激酶的滅活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞通過細(xì)胞周期，在前列腺癌細(xì)胞中下調(diào)Notch1的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5，6]；在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中抑制Notch1能夠增加細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]的表達(dá)能夠增加在耐藥的乳腺癌細(xì)胞株MCF7/VP中的表達(dá)較非耐藥細(xì)胞明顯增高，同時(shí)過表達(dá)Notch1能夠增加與耐藥相關(guān)的基因ABCC1的表達(dá)[8]。另一方面可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長(zhǎng)，如在腦膠質(zhì)瘤中通過活化P53的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞增長(zhǎng)[9]。Notchl通路具有多樣性和復(fù)雜性，而其與腫瘤耐藥的關(guān)系，目前報(bào)道尚少。本實(shí)驗(yàn)在前期對(duì)小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞株和敏感細(xì)胞株高通量芯片篩選中發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞株中Notch1的表達(dá)明顯增高，為了進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果，我們進(jìn)一步從基因和蛋白水平檢測(cè)了小細(xì)胞肺癌中Notch1的表達(dá)，和芯片結(jié)果一致。同時(shí)通過SiRNA下調(diào)Notch1的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性明顯增加，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示下調(diào)Notch1的表達(dá)后細(xì)胞凋亡明顯增加，Notch1可能通過抑制細(xì)胞凋亡來影響小細(xì)胞肺癌的耐藥，本實(shí)驗(yàn)為小細(xì)胞肺癌的耐藥機(jī)制的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)和研究方向。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Jemal A，Siegel R，Ward E，et al. Cancer statistics，2009[J]. CA Cancer J Clin，2009，59（4）：225—249.

[2] Chute JP，Chen T，F(xiàn)eigal E，et al. Twenty years of phase III trials for patients with extensiv—stage small—cell lung cancer：perceptible progress[J].J Clin Oncol，1999，17（6）：1794—1801.

[3] Sandler AB. Chemotherapy for small cell lung cancer[J]. Semin Oncol，2003，30（1）：9—25.

[4] Leong KG，Karsan A. Recent insights into the role of Notch signaling in tumorigenesis[J]. Blood，2006，107（6）：2223—2233.

[5] Sarmento LM，Huang H，Limon A，et al. Notch1 modulates timing of G1—S progression by inducing SKP2 transcription and p27 Kip1 degradation[J].J Exp Med，2005，202（1）：157—168.

[6] Wang Z，Zhang Y，Li Y，et al. Down—regulation of Notch—1 contributes to cell growth inhibition and apoptosis in pancreatic cancer cells[J]. Mol Cancer Ther，2006，5（3）：483—493.

[7] Fassl A，Tagscherer KE，Richter J，et al. Notch1 signaling promotes survival of glioblastoma cells via EGFR—mediated induction of anti—apoptotic Mcl—1[J]. Oncogene，2012.

[8] Cho S，Lu M，He X，et al. Notch1 regulates the expression of the multidrug resistance gene ABCC1/MRP1 in cultured cancer cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（51）：20778—20783.

[9] Lin H，Xiong W，Zhang X，et al. Notch—1 activation—dependent p53 restoration contributes to resveratrol—induced apoptosis in glioblastoma cells[J]. Oncol Rep，2011，26（4）：925—930.

（收稿日期：2012—07—18）