IGF—ⅠR抑制劑聯(lián)合西妥昔單抗對人肝癌細(xì)胞的體外抑制作用

[摘要] 目的 探討西妥昔單抗與胰島素樣生長因子—Ⅰ受體（IGF—ⅠR）抑制劑aIR3對人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞的作用。 方法 選用濃度遞增的西妥昔單抗（5～500） mg/mL和aIR3（2.5～250.0） μmol/L，單獨(dú)或聯(lián)合作用于HepG2細(xì)胞，觀察不同時(shí)間對細(xì)胞增殖的抑制作用以及聯(lián)用時(shí)的兩藥協(xié)同系數(shù)。 結(jié)果 單藥西妥昔單抗與aIR3對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用均呈濃度依賴性與時(shí)間依賴性，二藥單獨(dú)作用于HepG2細(xì)胞72 h最大抑制率分別為42.2%、82.3%，二藥聯(lián)合作用于HepG2細(xì)胞72 h最大抑制率達(dá)91.8%。西妥昔單抗與аIR3不同濃度在各時(shí)間點(diǎn)的協(xié)同系數(shù)均小于1。 結(jié)論 西妥昔單抗和aIR3在體外對HepG2細(xì)胞的增殖均具有一定的抑制作用，聯(lián)合應(yīng)用時(shí)具有明顯的協(xié)同效應(yīng)。

[關(guān)鍵詞] 肝癌細(xì)胞株；表皮生長因子受體；西妥昔單抗；胰島素樣生長因子—Ⅰ受體；aIR3

[中圖分類號(hào)] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673—9701（2012）26—0001—03

Effects of cetuximab combined with inhibitor of IGF—ⅠR on proliferation of human hepatocellular carcinoma cell lines HepG2

HAN Chunfan1 CHEN Yingrong2 CAI Weilong1 XIE Zhonghai1 WANG Yan1 SHEN Hua1 MIN Lishan2 WEI Feng1 DAI Licheng2

1.Department of Surgery， Huzhou Central Hospital， Huzhou 313000， China； 2.Huzhou Key Molecular Medical Laboratory， Huzhou 313000， China

[Abstract] Objective To evaluate the effects of cetuximab combined with inhibitor of insulin—like growth factor—Ⅰreceptor （IGF—ⅠR） aIR3 on proliferation of human hepatocellular carcinoma cell （HCC） lines HepG2. Methods Increasing concentrations of cetuximab （5—500） mg/mL and aIR3 （2.5—250.0） μmol/L， alone or in combination were administrated to HepG2 cells. The inhibitory effects of the drugs on cell proliferation at different time points were observed；the combination index （CI） of these two agents was calculated. Results The single agent of cetuximab and aIR3 inhibited the proliferation of HCC cells in a time— and dose—dependent manner. After treatment 72—hour，the proliferation inhibition rates of HepG2 cells were 42.2% and 82.3%. With maximal inhibitory effects of cetuximab combined aIR3， the proliferation inhibition rates of HepG2 was 91.8%. The CIs of different concentrations of the two agents at different time points were all less than 1， suggested that they have obvious synergistic activity. Conclusion The single agent of cetuximab and aIR3 can inhibit the proliferation of HepG2 cells， and they have obvious synergistic activity.

[Key words] Liver cancer cell lines； Epidermal growth factor receptor； Cetuximab； Insulin—like growth factor—Ⅰ receptor； aIR3

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，死亡率居各種惡性腫瘤的第二位[1]。研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者的肝癌組織與癌旁肝組織常高表達(dá)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），后者與肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移、放化療抗性等生物學(xué)特性密切相關(guān)[2]。EGFR抑制劑是一類新型靶向治療藥物，其中西妥昔單抗對人肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用已有許多報(bào)道[3]。胰島素樣生長因子—Ⅰ受體（insulin—like growth factor—Ⅰreceptor， IGF—ⅠR）信號(hào)通路在肝癌生長中的重要作用及IGF—ⅠR抑制劑對肝癌的抑制作用亦有文獻(xiàn)報(bào)道[4]，但I(xiàn)GF—ⅠR抑制劑與西妥昔單抗聯(lián)合應(yīng)用對人肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用是否存在協(xié)同作用目前仍無文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

西妥昔單抗與IGF—ⅠR抑制劑aIR3均購自德國默克制藥公司，CCK—8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒產(chǎn)自日本同仁化學(xué)研究所，RPMI—1640細(xì)胞培養(yǎng)液、10%新生小牛血清、含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的雙抗、0.25%胰酶溶液購自美國Gibco公司，分析純二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2購自中科院上海細(xì)胞所，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%小牛血清、含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI—1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2、85%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4天傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)

分為5組，包括空白對照組、細(xì)胞對照組、西妥昔單抗組、aIR3組、aIR3與西妥昔單抗聯(lián)合組，每組含3個(gè)復(fù)孔。HepG2細(xì)胞通過0.25%胰酶溶液消化，用RPMI—1640培養(yǎng)液稀釋并接種于96孔培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞密度達(dá)3×104/mL，置于恒溫箱中培養(yǎng)。兩藥單用時(shí)劑量分別為西妥昔單抗（5～500） mg/mL，aIR3（2.5～250.0） μmol/L，詳見表1，2。兩藥聯(lián)用時(shí)，按上述藥物劑量保持固定比例，詳見表3。分別培養(yǎng)24 h，48 h，72 h，通過酶標(biāo)儀測定各組吸光度值（A值），并計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

根據(jù)藥物協(xié)同作用中效原理，計(jì)算各組抑制率均數(shù)，經(jīng)生物軟件CalcuSyn計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度的兩藥聯(lián)合作用于HepG2細(xì)胞的協(xié)同系數(shù)（combination index，CI）。

2 結(jié)果

2.1 西妥昔單抗對HepG2細(xì)胞的作用

單藥西妥昔單抗對HepG2細(xì)胞有明顯抑制作用，且呈顯著的時(shí)間依賴性與濃度依賴性，隨藥物濃度增加與作用時(shí)間延長其抑制作用也顯著增強(qiáng)，見表1、圖1。作用72 h后其最大增殖抑制率為42.2%。

2.2 aIR3對HepG2細(xì)胞的抑制作用

aIR3以時(shí)間與濃度依賴性方式抑制HepG2細(xì)胞的增殖，見表2、圖2。培養(yǎng)72 h后其最大增殖抑制率達(dá)82.3%。

2.3 西妥昔單抗聯(lián)合aIR3對細(xì)胞的抑制作用

西妥昔單抗聯(lián)合aIR3可顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖，其抑制率較單藥顯著升高，作用72 h后，其最大增殖抑制率達(dá)91.8%，見表3、圖3。

2.4 西妥昔單抗與aIR3的協(xié)同作用系數(shù)

利用CalcuSyn軟件計(jì)算兩藥不同濃度在各時(shí)間點(diǎn)的CI值，結(jié)果顯示各時(shí)間點(diǎn)的CI值均小于1，提示西妥昔單抗與aIR3可協(xié)同抑制HepG2細(xì)胞的增殖，見表4。

3 討論

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其治療仍以外科手術(shù)為首選，但手術(shù)后易于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，傳統(tǒng)的化療和放療療效不佳，極大地影響了其療效與預(yù)后[5]。近年來分子靶向治療技術(shù)的飛速發(fā)展則為肝癌提供了一個(gè)新的治療途徑，EGFR抑制劑則是最受關(guān)注的領(lǐng)域之一。EGFR在許多惡性腫瘤中過高表達(dá)，并且EGFR高表達(dá)的惡性腫瘤患者預(yù)后較差。肝癌細(xì)胞中也常有表皮生長因子受體的表達(dá)，并與肝癌患者的臨床分期、肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移及組織分化程度等有關(guān)[6]。西妥昔單抗是一種人—鼠嵌合抗EGFR IgG1 MAb，屬于作用于胞外區(qū)的單克隆抗體，已被批準(zhǔn)用于治療依立替康復(fù)發(fā)的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌，對肝癌的抑制作用亦有文獻(xiàn)報(bào)道。IGF—ⅠR廣泛表達(dá)于多種類型的細(xì)胞表面，對正常細(xì)胞的生物學(xué)行為有著極其重要的作用，當(dāng)其表達(dá)過度時(shí)，細(xì)胞可以向惡性表型轉(zhuǎn)化。在多種腫瘤中均已檢測到IGF—ⅠR及其配體的表達(dá)異常。以IGF—ⅠR為靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)研究也屢見報(bào)道。胰島素樣生長因子Ⅰ型受體單克隆抗體аIR3對腫瘤的抑制作用已有不少報(bào)道[7]，但аIR3與西妥昔單抗聯(lián)合應(yīng)用抑制肝癌細(xì)胞增殖尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

在本研究中，西妥昔單抗與аIR3作用于人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞72 h后，其最大增殖抑制率分別為42.2%、82.3%，二藥聯(lián)合作用于HepG2細(xì)胞72 h后，最大抑制率達(dá)91.8%。西妥昔單抗與аIR3不同濃度在各時(shí)間點(diǎn)的CI值均小于1，表明二藥合用對HepG2細(xì)胞的增殖有顯著的協(xié)同抑制作用。研究表明，西妥昔單抗與EGFR特異性結(jié)合后，通過增加細(xì)胞周期抑制因子p27kip 的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞停留于G1期，從而抑制細(xì)胞增殖；通過增加凋亡促進(jìn)基因Bax表達(dá)和減少凋亡抑制基因bcl —2表達(dá)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。有文獻(xiàn)報(bào)道，aIR3可通過阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)凋亡等途徑抑制肝癌細(xì)胞增殖。還有報(bào)道，aIR3除可抑制IGF— I R功能及其下游受體絲氨酸/蘇氨酸Akt的磷酸化，還可降解IGF— I R。aIR3封閉IGF— I R，在體外可消除IGF— I R促增殖、抑制凋亡的作用，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到治療目的[9]。因此，西妥昔單抗與аIR3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制不同可能是其協(xié)同抑制HepG2細(xì)胞增殖的主要原因。但二藥在體內(nèi)對肝癌細(xì)胞的抗增殖作用及其詳細(xì)的作用信號(hào)通路尚需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2012—05—08）