重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-S12表達頭孢菌素?；傅恼T導條件優(yōu)化

摘 要:頭孢菌素?；窤cyⅡ可以直接水解CPC生成7-ACA，后者是重要的醫(yī)藥中間體，用來合成頭孢類抗生素。頭孢菌素?；窼12是AcyⅡ的突變體，其催化效率比AcyⅡ高。本文通過優(yōu)化頭孢菌素?；窼12在大腸桿菌BL21(DE3)中的誘導表達條件，為確定周期短、產(chǎn)率高且穩(wěn)定可靠的發(fā)酵工藝奠定基礎(chǔ)。利用單因素和正交設(shè)計對裝液量、接種量、誘導時間，誘導溫度和IPTG濃度等發(fā)酵條件進行了考察。單因素結(jié)果表明:裝液量為25ml/250ml三角瓶，接種量1%，指數(shù)生長開始加入0.05mM IPTG，28℃誘導20小時發(fā)酵液酶活最高;正交試驗結(jié)果表明:裝液量50ml/250ml三角瓶，接種量2%，指數(shù)生長開始加入0.05mM IPTG，誘導28℃且誘導24hours酶活最高，發(fā)酵液產(chǎn)酶水平達639.9U/L。方差分析結(jié)果顯示，發(fā)酵時間和裝液量對酶活影響極顯著，誘導時機對酶活影響顯著，接種量對酶活沒有顯著影響。驗證實驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液產(chǎn)酶水平最高可以達到802.9U/L。本實驗為該工程菌的發(fā)酵研究提供了最佳的表達誘導條件，對下一步的研究具有指導意義。

關(guān)鍵詞:頭孢菌素?；?發(fā)酵 誘導條件優(yōu)化 正交試驗設(shè)計

中圖分類號:TQ文獻標識碼:A文章編號:1674-098X(2012)04(b)-0249-02

頭孢菌素是應(yīng)用廣泛的β-內(nèi)酰胺類抗生素，是7-氨基頭孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，以下簡稱7-ACA)的衍生物，通過7-ACA來生產(chǎn)的半合成頭孢菌素占世界抗生素市場40％以上的份額。因此作為合成半合成頭孢菌素的重要中間體，7-ACA的研究生產(chǎn)至關(guān)重要。目前化學和酶法都可以用來從頭孢菌素C(以下簡稱CPC)生產(chǎn)7-ACA?；瘜W法通過利用亞硝酰氯法或者硅酯裂解法從CPC化學脫酰而得，因為使用硅保護基團保護氨基和羧基，所以產(chǎn)量可以達到90％以上。但是，化學法操作復雜，對條件要求苛刻，造成生產(chǎn)上的嚴重浪費且產(chǎn)生的副產(chǎn)品對環(huán)境有害，這些昂貴的步驟和對有毒廢料的處理都造成了生產(chǎn)成本的提高。為了克服化學法的缺點，有人提出了兩步酶法。如今，化學方法基本已被兩步酶法取代。頭孢菌素酰化酶就是CPC在酶法脫酰成為7-ACA過程中起到關(guān)鍵作用的酶。

現(xiàn)已報道的具有頭孢菌素酰化酶活力的菌株通常都從土壤或污水中篩選得到。與常規(guī)方法比較，利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)具有周期短、成本低、過程易于規(guī)范控制等諸多優(yōu)點，且由于發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡單、酰化酶基因可受啟動子基因調(diào)控，使其具備易純化、可誘導和產(chǎn)量高的特點。因此利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)頭孢菌素?；赋蔀閲鴥?nèi)外學者研究的熱點。

Matsuda從Pseudomonas sp．SE83中克隆了可以催化CPC脫酰為7-ACA的acyⅡ?；富颍琒hin通過定向進化的方法，篩選得到一株6個氨基酸位點發(fā)生突變的突變體，酶活提高到突變前的8倍，命名為S12。本實驗室通過基因合成獲得全長目的基因，將其構(gòu)建到pET-28a表達載體上，即pET-28a-S12，在 BL21(DE3)中誘導表達，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測后，確定蛋白是由58kDa和25kDa大小2個亞基組成，與文獻報導一致。酶的誘導表達是發(fā)酵過程的一部分，此酶在大腸桿菌中的最佳誘導條件至今無報導。本文的目的是在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，優(yōu)化S12的誘導表達條件，使酶活提高，為整個發(fā)酵過程奠定基礎(chǔ)。單因素實驗確定誘導表達相關(guān)參數(shù)，正交實驗和方差分析確定相關(guān)參數(shù)的影響水平。利用正交實驗的最優(yōu)組合，酶活最高可以達到802.94U/L。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-28a-S12由上海生工構(gòu)建

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑

Trypton、Yeast extract、瓊脂粉:北京奧博星生物技術(shù)有限公司;氯化鈉、PDAB(對二甲氨基苯甲醛)、無水甲醇(分析純)、葡萄糖:北京化學試劑廠;丙烯酰胺、IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、卡那霉素、β-疏基乙醇:Amresco公司;冰乙酸(優(yōu)級純):國藥集團;SDS(十二烷基硫酸鈉)、Tris:Sigma;蛋白低分子量標準:購于TaKaLa。

1.2.2 儀器

高速離心機DL-16B，電泳儀 ECP3000，電泳槽DY-CY31A，Y92-1超聲波破碎儀，振蕩培養(yǎng)箱ZDP-250，電熱恒溫培養(yǎng)箱 DNP-9272，電子天平TA5002，分光光度計Unico2100，酸度計HANNA HI 221。

1.3 菌種活化

挑取1環(huán)-80℃甘油凍存的工程菌，在LB固體培養(yǎng)基中(卡那霉素50ug/ml)劃線培養(yǎng)過夜，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中(卡那霉素50ug/ml)培養(yǎng)過夜。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)

選用LB培養(yǎng)基，采用單因素實驗測定葡萄糖、裝液量、接種量、培養(yǎng)時間、誘導劑(IPTG)濃度、誘導時間、誘導溫度對發(fā)酵液酶活的影響，以菌體破碎后的粗酶液的酶活高低為原則確定各單因素下最適條件，每組實驗重復3次，取平均值。

1.5 目的蛋白表達水平檢測

將誘導后的菌體4℃、12000r/min離心5min搜集菌體，將菌體重懸于Tris緩沖液中，冰浴中超聲波破碎(40W、工作5s、間歇 5s、30次)，4℃、12000r/min離心15min，取上清液并將沉淀溶于Tris緩沖液中，12%的SDS-PAGE凝膠電泳鑒定。

1.6 酶活測定

參見Lee等的研究方法，取0.5ml粗酶液，加入0.5ml底物(用pH8.0 Tris緩沖液配配制20%CPC)，37℃水浴8min，加入3ml終止液和0.5ml顯色液。振蕩混勻后靜置15min，12000rpm離心5min。取上清液于415nm處測定光吸收值?？瞻讓φ諡橄燃咏K止液，后加底物。37℃、1min生成1μmol 7-ACA定義為1個酶活單位(U)。

1.7 搖瓶發(fā)酵條件的正交試驗優(yōu)化

采用正交試驗法將對發(fā)酵液酶活有影響的單因素進行組合，按L16(45)正交表安排正交試驗。每個實驗處理進行3次重復，取平均值。通過對結(jié)果的極差分析，確定最優(yōu)組合。通過方差分析確定四因素影響顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖對發(fā)酵液酶活和蛋白表達量的影響

250ml搖瓶內(nèi)分別裝100ml LB、100ml LBG(LB+0.5%葡萄糖)，37℃，初始pH為7.2，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，接種量1%，4h后，加入0.05mM IPTG，誘導4h，結(jié)果表明，LBG的發(fā)酵液酶活比LB的發(fā)酵液酶活低，其外源蛋白的表達量卻高于LB。

LB是一種營養(yǎng)豐富的半合成培養(yǎng)基，基本具備了大腸桿菌生長所需要的全部營養(yǎng)元素，葡萄糖是容易被微生物利用的碳源，希望借添加葡萄糖來提高發(fā)酵液酶活，但實驗發(fā)現(xiàn)，添加葡萄糖后表達量提高，發(fā)酵液酶活降低了，這與野生菌發(fā)酵產(chǎn)酶的規(guī)律是不一樣的，推斷是因為誘導表達的胞內(nèi)酶量大時，會使外源蛋白不能及時實現(xiàn)正確的折疊，導致可溶性粗酶蛋白液中存在很大部分折疊介于完全正確和完全不正確的結(jié)構(gòu)的蛋白，雖然表達總酶量上升了，但有效酶量卻減少了，導致酶活降低，所以葡萄糖的加入不能使此工程菌表達出具有高發(fā)酵液酶活的?；?。

2.2 種子培養(yǎng)時間的確定

種子培養(yǎng)時間即種齡，對大腸桿菌發(fā)酵過程的影響較大。適宜的種齡應(yīng)是菌種對數(shù)生長的中后期，此時的種子具有較強的生長活力，而且菌體濃度相對較高，有利于大腸桿菌的迅速積累。由菌種的生長曲線可知，2h以內(nèi)是遲滯期，此時菌體為自身進行各種物質(zhì)合成和分解做著準備。2h進入指數(shù)生長期，8h菌種正處于指數(shù)生長中后期，菌濃度較高，菌體生長旺盛，因此選擇種子培養(yǎng)時間為8h。

2.3 接種量對發(fā)酵液酶活的影響

接種量的大小對發(fā)酵周期的長短和發(fā)酵水平的高低有一定的影響。接種量太小，菌種增殖緩慢，培養(yǎng)時間延長，會造成菌絲結(jié)塊等發(fā)酵異常，不利于菌體生長和產(chǎn)酶;而接種量過大，會使菌種生長過快，培養(yǎng)基黏度增加，導致基質(zhì)消耗過快，溶氧不足，菌種容易衰老，也不利于產(chǎn)酶。因此，應(yīng)采用適合的接種量，在合理地縮短發(fā)酵周期的同時，又能得到較高的發(fā)酵水平。將培養(yǎng)8h的新鮮種子按 0.1%、0.3%、0.5%、1%、2%和5%的接種量分別接入培養(yǎng)基中，接種量以1%或2%為好，此時發(fā)酵液酶活較高;接種量超過2%，對酶活有一定的抑制。

2.4 裝液量對發(fā)酵液酶活的影響

搖瓶裝液量與溶解氧濃度有關(guān)，所以對發(fā)酵水平的高低有一定的影響。裝液量太小，設(shè)備利用率低，增加工業(yè)投入成本;而裝液量過大，培養(yǎng)液中溶解氧少，菌種容易衰老，不利于產(chǎn)酶。因此，采用適合的裝液量，能得到較高的發(fā)酵水平。以250ml搖瓶，分別盛放25ml、50ml和100ml培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)25ml培養(yǎng)基對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶效果最好，隨著培養(yǎng)基的增多，對酶活有一定的抑制。

2.5 誘導時機對發(fā)酵液酶活的影響

將8小時的種子液按1%接種于新鮮培養(yǎng)基中，測定其生長曲線，從生長曲線我們可以推斷，工程菌在不同的生長時期，其表達的酶活一定存在差異。所以本文選取不同的生長時期加入IPTG，發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)接后2h，即指數(shù)生長開始是最佳的誘導時機。

2.6 誘導溫度對發(fā)酵液酶活的影響

加入終濃度為0.05mmol/L的IPTG后，分別設(shè)定溫度為16℃、20℃、25℃、28℃和37℃，誘導，在溫度為28℃時發(fā)酵液酶活最高，因此誘導表達的最佳溫度可以確定在 28℃。

對于工程菌，一般采用菌體生長階段和產(chǎn)物生成階段的2階段發(fā)酵模式，不同的階段有不同的目的，因此培養(yǎng)溫度也要隨之改變。前期優(yōu)先促進菌體生長，以獲得足夠的生物量，后期以目的蛋白表達為主，溫度要適當調(diào)整，適宜的溫度可以促進外源蛋白的表達，否則會抑制。本試驗中發(fā)現(xiàn)當誘導溫度為28℃時，酶活最高，當溫度過高或過低時酶活都降低?？赡苡捎跍囟冗^低時菌體生長代謝緩慢，蛋白表達受抑制，當溫度過高時菌體自身蛋白表達占上風，外源蛋白表達受抑制。

2.7 IPTG濃度對發(fā)酵液酶活的影響

1%接種后4小時開始添加IPTG，終濃度為0.01mmol/L、0.05mmol/L、0.5mmol/L、和1.0mmol/L，28℃誘導表達，結(jié)果表明，當IPTG濃度為0.05mmol/L時發(fā)酵液酶活最高，當IPTG濃度升高為1.0mmol/L時酶活降低，可能由于IPTG濃度過高對菌體產(chǎn)生了毒害作用。

外源基因克隆在含有l(wèi)ac啟動子的表達系統(tǒng)中，lacI產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱基因結(jié)合抑制下游的外源基因轉(zhuǎn)錄，便可以實現(xiàn)宿主菌生長，向培養(yǎng)基中加入誘導物 IPTG(異丙基硫代-D-半乳糖)，解除lacI抑制使外源基因大量表達。但是當IPTG濃度過高時會對菌體產(chǎn)生毒害作用，抑制外源蛋白表達。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，搖瓶中0.05mmol/L的IPTG就足以誘導啟動子完全開放，這對大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中降低發(fā)酵成本有積極意義。

2.8 誘導時間對目的基因表達水平的影響

在搖瓶培養(yǎng)到指數(shù)生長開始時，加入0.05mmol/L IPTG，28℃分別誘導2h、4h、6h、8h、10h、12h和20h，發(fā)酵液酶活隨誘導時間的延長而提高，當達到20h時酶活穩(wěn)定。結(jié)果如圖10表明，菌體處于對數(shù)生長期時，生長速度較快，外源蛋白有少量表達，當進入到誘導狀態(tài)后，生長速度下降，以表達外源蛋白為主，當達到一定時間后，發(fā)酵液中營養(yǎng)的消耗，氧氣的缺乏使得菌體的生長進入平臺期，即產(chǎn)生和自溶互相抵銷，影響了外源蛋白的積累。

2.9 正交實驗結(jié)果

由極值的變化推知，各因素的重要性依次為誘導時間、裝液量、誘導時機和接種量。最優(yōu)誘導條件為:誘導時間24h、裝液量50ml、誘導時機是在轉(zhuǎn)接后2h、接種量是2%，最佳組合為A2B2C2D3。方差分析結(jié)果表明，發(fā)酵時間和裝液量對酶活有極顯著影響，誘導時機對酶活有顯著影響，接種量對酶活沒有影響。

為提高統(tǒng)計分析的可靠性，給出了對正交試驗得出的較優(yōu)組合進行驗證的兩組實驗結(jié)果。與正交試驗中A2B2C2D3發(fā)酵液酶活639.9U/L相比，驗證組合A2B2C2D3的發(fā)酵液酶活提高了25%。

3 結(jié)論

本文對工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-S12的誘導條件進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄糖對產(chǎn)酶水平有顯著的影響，接種量、誘導時機、誘導時間和誘導劑的濃度對菌體的產(chǎn)酶有影響，最佳的誘導時機為菌體培養(yǎng)4h，處于對數(shù)生長前期(OD600≈1.5)，這與文獻報道的重組大腸桿菌的發(fā)酵在對數(shù)生長末期誘導有差異，與廖美德等報道的在對數(shù)生長前中期接近。誘導劑IPTG添加量影響菌體生長和外源基因的表達，這與Babu等的報道相同，當IPTG濃度0.05mmol/L誘導效果最好。方差分析結(jié)果表明，發(fā)酵時間和裝液量對酶活有極顯著影響，誘導時機對酶活有顯著影響，接種量對酶活沒有影響。最優(yōu)組合誘導條件為:誘導時間24h、裝液量50ml、誘導時機是在轉(zhuǎn)接后2h、接種量是2%，酶活達到639U/L。驗證實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液產(chǎn)酶水平最高達802.94U/L，沒有達到1207U/L，推測是與表達載體和誘導方法有關(guān)，如文獻中使用乳糖作為誘導劑，一方面起到誘導作用，一方面可以作為碳源，在今后的高密度發(fā)酵研究中，考慮引用乳糖作為碳源和誘導物。外源蛋白的表達是發(fā)酵過程的重要組成部分，合適的誘導條件可以使發(fā)酵產(chǎn)物達到最大。具體發(fā)酵工藝今后研究。

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