熒光顯微圖像亞細(xì)胞斑點(diǎn)檢測方法研究進(jìn)展

吳 堅(jiān) 趙 挺 譚映軍 李瑩輝 鄭筱祥，*

1（浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院，生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省心腦血管

檢測技術(shù)與藥效評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310027）2（浙江大學(xué)求是高等研究院，杭州 310027）3（中國航天員科研訓(xùn)練中心，航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100094）

引言

隨著顯微鏡和信息處理技術(shù)的發(fā)展，越來越多的科技工作者使用高性能熒光顯微鏡（LSCM、雙光子、TRIFM等）觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分（蛋白質(zhì)囊泡、染色體、微絲等）及其動(dòng)力學(xué)特性（囊泡遷移、融合、有絲分裂等），得到海量的圖像數(shù)據(jù)［1-6］。人工處理這些數(shù)據(jù)不僅工作十分繁瑣，同時(shí)受到成像質(zhì)量不高、觀察對象特征復(fù)雜、人工診斷主觀性較強(qiáng)、觀察者視覺疲勞等因素的影響，分析結(jié)果往往假陽性率和假陰性率高，所以借助圖像處理與分析技術(shù)提供客觀的定量數(shù)據(jù)，幫助量化并驗(yàn)證所觀察到的生命過程，就顯得尤為必要［7-11］。特別是在蛋白質(zhì)組學(xué)、功能性基因組學(xué)和藥物篩選等生物學(xué)研究領(lǐng)域，自動(dòng)分析處理高通量數(shù)據(jù)具有重要意義［12-13］。

生物顯微圖像處理首先要解決的是自動(dòng)準(zhǔn)確檢測觀察對象，例如解釋復(fù)雜的細(xì)胞顯型常常需要知道特定細(xì)胞器在細(xì)胞中的位置、數(shù)量、聚集度等參數(shù)［14］；利用共聚焦顯微鏡觀察得到的細(xì)胞圖像進(jìn)行計(jì)算機(jī)三維重構(gòu)，依賴準(zhǔn)確檢測亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分［15］；活細(xì)胞序列成像中，追蹤特定分子探針標(biāo)記的亞細(xì)胞目標(biāo)，需要在每幀圖像中確定追蹤對象的準(zhǔn)確位置［16-18］。被特定熒光探針標(biāo)記的亞細(xì)胞觀察對象，在細(xì)胞圖像中常以模糊亮斑的形式出現(xiàn)，其亮度高于背景，面積相對較小又較為致密，且沒有明顯的邊界，稱之為亞細(xì)胞斑點(diǎn)。目前常用的生物圖像處理軟件（如ImageJ等）更多的是采用閾值法來檢測斑點(diǎn)。雖然簡便，但沒有經(jīng)過濾波處理，過度依賴圖像質(zhì)量和閾值的選取，效果往往很不理想。

文中就生物熒光顯微圖像中常見的亞細(xì)胞斑點(diǎn)問題，在分析熒光圖像中所含的噪聲類型和圖像形成過程的基礎(chǔ)上，對其檢測方法進(jìn)行綜述，按照設(shè)計(jì)思想對方法加以歸納、總結(jié)、分類，最后總結(jié)討論了各檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)和該研究領(lǐng)域仍然存在的難點(diǎn)。

1 熒光顯微圖像中的噪聲

由于成像過程的局限，得到的圖像往往信噪比較低，而且圖像中斑點(diǎn)數(shù)量較多，聚集度高，相互粘連，且常常淹沒在周圍復(fù)雜的背景中，如圖1（a）所示原代脂肪細(xì)胞中的Glut4囊泡。在活細(xì)胞熒光顯微成像時(shí)，為了防止熒光淬滅和熒光染料化學(xué)損傷，光照強(qiáng)度常被設(shè)置得很低，所以得到的圖像信噪比更低，如圖1（b）所示活細(xì)胞工作站拍攝的C2C12骨骼肌細(xì)胞中的Glut4囊泡。生物熒光顯微圖像中強(qiáng)噪聲干擾的存在使得自動(dòng)斑點(diǎn)檢測極具挑戰(zhàn)性［11，19-21］。

圖1 細(xì)胞圖像中的Glut4囊泡斑點(diǎn)。（a）原代脂肪細(xì)胞；（b）C2C12骨骼肌細(xì)胞Fig.1 The Glut4 vesicle spots in cell images.（a）A primary adipocyte；（b）A C2C12muscle cell

顯微成像儀器設(shè)計(jì)制造，一直致力于改進(jìn)由于相位失真和光學(xué)相差而引入的干擾。然而，在實(shí)際應(yīng)用中干擾是無處不在的，沒有哪一個(gè)光學(xué)系統(tǒng)可以完全避免。成像系統(tǒng)中顯微鏡的光源、物鏡、分光鏡、光敏檢測器等關(guān)鍵部件以及顯微鏡的類型，都需要很好地調(diào)整和選擇才能獲得高信噪比的銳利圖像。既使所有的部件都已調(diào)試得很好，各部件的物理局限還是會(huì)給圖像帶來固有噪聲，主要有：因光子產(chǎn)生的隨機(jī)性，給光敏檢測器帶來的Poisson型光子散射噪聲；由于誘發(fā)電子熱攪動(dòng)引起劇烈震蕩所形成的暗流，溫度越高，暗流也越劇烈，同樣服從Poisson分布；電子設(shè)備在數(shù)據(jù)讀取時(shí)會(huì)產(chǎn)生讀出噪聲，幅值與讀取速率逆相關(guān)，功率譜密度隨著1/f遞減，表現(xiàn)為加性Gaussian噪聲；幅值量化過程中的量化噪聲是A/D轉(zhuǎn)換設(shè)備固有的［22］，與信號(hào)無關(guān)，實(shí)際使用中可將其控制在其他噪聲均方根一半以內(nèi)［11］。

此外，熒光染料的光學(xué)性質(zhì)與成像密切相關(guān)，同樣也會(huì)成為影響圖像質(zhì)量的重要因素，如有機(jī)或無機(jī)分子的自發(fā)熒光是圖像中常見的背景干擾。同時(shí)，光在激發(fā)和發(fā)射時(shí)由于粒子性會(huì)發(fā)生散射，在不同介質(zhì)間傳輸會(huì)發(fā)生折射，所以隨著樣本觀察的深入，激發(fā)光被樣本材料吸收導(dǎo)致樣本發(fā)射熒光能力減弱。

2 熒光顯微成像中的圖像形成

目前，廣泛使用的熒光顯微鏡都是落射成像系統(tǒng)，其激發(fā)光和發(fā)射光通過同一物鏡，成像過程是非相干的。當(dāng)激發(fā)光照射到樣本上時(shí)，樣本中的每個(gè)熒光團(tuán)分子被激發(fā)作為第二光源（點(diǎn)光源），通過物鏡成像并被光敏檢測器檢測到，其對圖像亮度分布的貢獻(xiàn)是獨(dú)立的。顯微成像系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（point spread function，PSF）是點(diǎn)光源通過物鏡成的像，即物鏡系統(tǒng)的沖擊響應(yīng)。理論上PSF能夠表示為標(biāo)量Debye衍射積分，也可以表示為出瞳函數(shù)（pupil function）的二維Fourier變換。例如波長為λ的窄帶非相干點(diǎn)光源通過直徑為a的圓形孔徑物鏡所形成的PSF是圓形對稱的，可以表示為

式中，J1是第一類一階Bessel函數(shù)，常數(shù)r0=λdi/a是尺度因子，di為像距，徑向距離r代表像中的每個(gè)點(diǎn)與像平面原點(diǎn)的距離。

實(shí)際上PSF可以根據(jù)圖像數(shù)據(jù)的維數(shù)用二維或三維Gaussian函數(shù)非常準(zhǔn)確地近似［23-24］，如圖2所示：其中圖（a）尺寸為31像素×31像素，中心亮度為255；圖（b）尺寸為91像素×91像素，點(diǎn)光源坐標(biāo)為（46，46），亮度為255；圖（c）為點(diǎn)光源與PSF卷積所成的像（斑點(diǎn)），尺寸同圖（b）。

因此，熒光顯微成像系統(tǒng)可以建模為線性空間移不變系統(tǒng)，圖像的形成就是每一個(gè)點(diǎn)光源成像的線性集合，那么圖像亮度分布可以表示為式中，M是物鏡的放大倍數(shù)，χ函數(shù)與熒光團(tuán)有關(guān)，描述樣本在激發(fā)光下發(fā)射波長為λ的熒光的能力。

圖2 二維Gaussian函數(shù)模擬的非相干點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。（a）點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)三維示意圖；（b）點(diǎn)光源；（c）點(diǎn)光源的像Fig.2 The incoherent PSF simulated with 2D Gaussian distribution.（a）3D PSF schematic diagram；（b）A point source；（c）An image of point source（b）

3 斑點(diǎn)檢測方法

除了簡單的閾值法外，常見的斑點(diǎn)檢測方法都是通過分析熒光顯微圖像的形成過程構(gòu)造合適的函數(shù)模擬PSF，考慮圖像的噪聲類型選用合適的降噪技術(shù)，針對斑點(diǎn)的形狀和大小選擇合適的參數(shù)。檢測流程大體上包括降噪濾波、信號(hào)增強(qiáng)、信號(hào)閾值化等3個(gè)步驟。降噪濾波初步去除圖像包含的噪聲（灰度圖像），信號(hào)增強(qiáng)進(jìn)一步增強(qiáng)目標(biāo)信號(hào)抑制背景干擾和噪聲（灰度圖像），信號(hào)閾值化通過設(shè)置硬或軟閾值提取檢測目標(biāo)（二值圖像）。在實(shí)際操作過程中，不同的檢測方法在每一步執(zhí)行上又有所區(qū)別，一些步驟是可以選擇或合并的。例如有的方法自身帶有降噪的效果，不需要添加額外的降噪步驟，但是所有的檢測方法都離不開信號(hào)增強(qiáng)，因?yàn)檫@是各檢測方法最顯著的區(qū)別。整體檢測流程如圖3所示。

圖3 斑點(diǎn)檢測流程Fig.3 The spot detection framework

3.1 降噪濾波

去除原圖像中的噪聲能有效改善信噪比，提高圖像質(zhì)量和目標(biāo)的可檢測性。熒光顯微圖像中噪聲的主要來源是Poisson型光子散射噪聲和加性Gaussian型讀出噪聲。前者是光子發(fā)射隨機(jī)性引起的，雖然可以通過提高光照強(qiáng)度或增加曝光時(shí)間被極大地降低，但會(huì)引起熒光漂白現(xiàn)象；后者是檢測器件的電子特性引起的；兩者相互獨(dú)立。大多數(shù)情況下，降噪處理使用計(jì)算復(fù)雜度較低的高斯平滑（Gaussian smoothing）［25］或匹配濾波（match filtering）［26］。一些非線性濾波技術(shù)，如多尺度小波降噪［27］、Patch-based降噪［28］、方差穩(wěn)定變換（variance stabilizing transform，VST）［29］、形態(tài)學(xué)濾波［30］等也在一些文獻(xiàn)報(bào)道中出現(xiàn)。特別是文獻(xiàn)［29］將Poisson型或Poisson-Gaussian混合型噪聲轉(zhuǎn)變?yōu)榻艷aussian型噪聲來處理，能有效去除熒光顯微圖像中的光子散射噪聲和讀出噪聲。

3.2 信號(hào)增強(qiáng)

信號(hào)增強(qiáng)是在降噪后的圖像中，進(jìn)一步增強(qiáng)目標(biāo)信號(hào)同時(shí)抑制不相關(guān)的背景。在這個(gè)步驟中并沒有檢測出目標(biāo)或圖像特征，因?yàn)樘崛〔怀隹梢粤炕臄?shù)據(jù)，如目標(biāo)的位置、個(gè)數(shù)、面積等信息，仍需要依靠后續(xù)處理連接屬于同一目標(biāo)的像素。目前采用的方法大多數(shù)是無監(jiān)督型的，通過顯式或隱式假設(shè)目標(biāo)模型，手動(dòng)或半自動(dòng)調(diào)整參數(shù)達(dá)到應(yīng)用于特定情況下的最佳效果。文獻(xiàn)［31］將各種方法按照數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)型和模型驅(qū)動(dòng)型分為從底至頂（from bottom to top）和從頂至底（from top to bottom）兩類。本文選擇其中8種常用方法，按照它們的設(shè)計(jì)思想概括為基于匹配濾波的、基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的和基于小波多尺度等3類加以介紹。表1列舉了各方法的特點(diǎn)。

表1 斑點(diǎn)檢測方法Tab.1 The spot detection methods

3.2.1 基于匹配濾波的方法

匹配濾波方法主要是通過模擬PSF，將濾波后的圖像與類點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)核進(jìn)行卷積運(yùn)算，然后在斑點(diǎn)存在區(qū)域（其圖像亮度分布與核匹配）內(nèi)產(chǎn)生高強(qiáng)度響應(yīng)，而在圖像的其他區(qū)域內(nèi)只有低強(qiáng)度響應(yīng)，以達(dá)到增強(qiáng)目標(biāo)和抑制不相關(guān)背景的目的。該類方法的參數(shù)需要針對斑點(diǎn)的尺寸合理選擇。最為常見的是采用Gaussian核，以下是對其有效改進(jìn)后的3種方法。

（1）斑點(diǎn)增強(qiáng)濾波器

文獻(xiàn)［32］提出的斑點(diǎn)增強(qiáng)濾波器（spot enhancing filter，SEF），使 用 Laplacian of Gaussian（LoG）核取代Gaussian核近似白化匹配濾波器來增強(qiáng)目標(biāo)抑制噪聲。原圖像I與LoG核（2－i2－j2）GσL卷積，得到目標(biāo)增強(qiáng)圖像 C，其中 GσL是Gaussian核，參數(shù) σL是 L oG核寬，與斑點(diǎn)的尺寸大小有關(guān)。最后，通過信號(hào)閾值化操作提取斑點(diǎn)目標(biāo)。SEF將降噪濾波和信號(hào)增強(qiáng)兩步結(jié)合在一起實(shí)現(xiàn)，計(jì)算簡便，但提取目標(biāo)過度依賴閾值選取。

（2）亞像素定位檢測

文獻(xiàn)［16］提出的亞像素定位（sub-pixel location，SPL）檢測是序列圖像中目標(biāo)追蹤的關(guān)鍵步驟。SPL首先通過相鄰w幀圖片的時(shí)間平均有效降低背景噪聲干擾；然后逐點(diǎn)在3像素×3像素區(qū)域內(nèi)初步找出圖像的局部最大值，并規(guī)定該最大值滿足背景標(biāo)準(zhǔn)差的α倍時(shí)有效；最后在每個(gè)有效的局部最大值位置對原圖像I進(jìn)行混合Gaussian模型迭代擬合逐個(gè)提取斑點(diǎn)。在某一局部最大值處，當(dāng)擬合完第k+1個(gè)核后與原圖像的差異在統(tǒng)計(jì)意義上明顯小于擬合k（≥1）個(gè)核后的差異時(shí)，擬合繼續(xù)，否則擬合結(jié)束，具體參見文獻(xiàn)［24］。SPL主要是針對追蹤問題設(shè)計(jì)的，它只能提供目標(biāo)的位置信息（有效局部最大值），可以用來統(tǒng)計(jì)圖像中斑點(diǎn)的個(gè)數(shù)，不能進(jìn)行斑點(diǎn)像素級分析，得益于Gaussian迭代擬合，可檢測粘連目標(biāo)。

（3）特征點(diǎn)檢測

文獻(xiàn)［17］提出的特征點(diǎn)檢測（Feature Point Detection，F(xiàn)PD）也來源于目標(biāo)追蹤問題，最初設(shè)計(jì)用于檢測膠質(zhì)顆粒［33］。FPD首先選擇合適參數(shù)的Gaussian卷積核對原圖像I進(jìn)行復(fù)原，其中Kw0和B是歸一化常數(shù)，λn和w分別定義Gaussian核寬和可調(diào)核窗寬度，w取值應(yīng)大于最大斑點(diǎn)半徑小于斑點(diǎn)間最小距離；然后通過灰度形態(tài)學(xué)膨脹操作提取圖像的局部最大值，用mean-shift方法結(jié)合周圍像素值優(yōu)化局部最大值位置；最后分別計(jì)算每個(gè)局部最大值對應(yīng)點(diǎn)集（中心為局部最大值，半徑為w）亮度的一階矩和二階矩，以此來判斷該點(diǎn)集是否對應(yīng)檢測目標(biāo)。FPD和SPL一樣，也只能得到斑點(diǎn)的位置信息（優(yōu)化的局部最大值）。

3.2.2 基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的方法

數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)處理依靠膨脹、腐蝕、開和閉等4種基本操作的靈活組合，可以實(shí)現(xiàn)包括圖像濾波、分割、測量、以及紋理分析和合成等功能。該類檢測操作針對斑點(diǎn)的形態(tài)構(gòu)建合適的結(jié)構(gòu)元素，通過相應(yīng)的形態(tài)學(xué)運(yùn)算，將其從局部不相關(guān)背景中提取出來。結(jié)構(gòu)元素的選取與斑點(diǎn)的形狀、大小和方向等先驗(yàn)知識(shí)有關(guān)。

（1）灰度開運(yùn)算頂帽變換

文獻(xiàn)［34］提出的灰度開運(yùn)算頂帽（grayscale opening top-hat，GOTH）變換，利用開操作去除相關(guān)的斑點(diǎn)圖像目標(biāo)，再通過開圖像與原圖像之間的算術(shù)差分運(yùn)算提取斑點(diǎn)，具體做法如下：先用核寬為σ的Gaussian核對原圖像I進(jìn)行濾波，得到濾波圖像J；再用半徑為r的平圓盤結(jié)構(gòu)元素A對J進(jìn)行開操作得到JA，其中結(jié)構(gòu)元素的半徑與最大斑點(diǎn)的尺寸有關(guān)；最后濾波圖像J與JA進(jìn)行差分運(yùn)算，即J－JA得到目標(biāo)增強(qiáng)圖像C，最后通過信號(hào)閾值化提取斑點(diǎn)目標(biāo)。該方法與試圖直接抑制不相關(guān)背景提取目標(biāo)的思路相反，其在低信噪比圖像中檢測效果不好，過度依賴閾值選取。

（2）H-Dome變換

文獻(xiàn)［18］提出的H-Dome變換，也是用于追蹤過程的目標(biāo)檢測，實(shí)質(zhì)上是提取亮度局部最大值的形態(tài)學(xué)H-maxima操作［11］，只是做了s次冪的擴(kuò)展，并進(jìn)行檢測結(jié)果的判別。該方法可以分為濾波、形態(tài)學(xué)重構(gòu)、結(jié)果判別3個(gè)步驟，具體操作如下：原圖像I通過核寬為σL的LoG核濾波后得到濾波圖像J；將J－h(huán)作為標(biāo)記對J進(jìn)行形態(tài)學(xué)重構(gòu)得到重構(gòu)圖像B，其中h＞0是常數(shù)，與斑點(diǎn)和相應(yīng)背景的最小亮度差有關(guān)。H-Dome圖像為

對H中的每點(diǎn)像素值提升s次冪可以有效增強(qiáng)目標(biāo)抑制背景，即再通過Important Resampling算法從H（i，j）s中重新采樣N個(gè)像素點(diǎn)，用mean-shift算法聚類成M個(gè)點(diǎn)集對應(yīng)檢測目標(biāo)，最后計(jì)算每個(gè)點(diǎn)集對應(yīng)協(xié)方差矩陣行列式的值與給定閾值σM比較判斷該點(diǎn)集是否有效，并得到目標(biāo)的位置信息（點(diǎn)集mean-shift聚類中心）。

（3）基于旋轉(zhuǎn)操作的頂帽變換

文獻(xiàn)［30］介紹的方法除了可用于圖像濾波外，也可以用于檢測斑點(diǎn)。該方法基于旋轉(zhuǎn)操作的頂帽（rotational morphological processing based top-hat，RMPTH）變換，采用直線片段結(jié)構(gòu)元素L（1×N），N為長度?？紤]到在離散空間中旋轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)元素很難在任意角度產(chǎn)生直線結(jié)構(gòu)，所以采用將原圖像I順時(shí)針旋轉(zhuǎn)πi/M［rad］（i=0，1，…，M－1）后與固定位置的結(jié)構(gòu)元素L進(jìn)行開操作得到Oi，再將M個(gè)Oi相應(yīng)逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)πi/M［rad］得到O'i，最終RMPTH變換結(jié)果

對應(yīng)目標(biāo)增強(qiáng)圖像C，最后通過信號(hào)閾值化提取斑點(diǎn)目標(biāo)。得益于單像素寬度的結(jié)構(gòu)元素，該方法能夠區(qū)分粘連的斑點(diǎn)。

3.2.3 基于小波多尺度的方法

多尺度小波分析將空域局部性和頻域局部性相結(jié)合，使其可以對信號(hào)進(jìn)行稀疏表達(dá)。這種稀疏性在圖像數(shù)據(jù)壓縮、噪聲濾波和圖像特征檢測中得到廣泛應(yīng)用。該類方法主要是利用特定小波變換將圖像分解為多個(gè)尺度分量，然后分別對相應(yīng)尺度分量進(jìn)行軟或硬閾值操作，再將尺度分量部分相加或相乘，以達(dá)到噪聲過濾和目標(biāo)檢測的目的。

（1）小波多尺度乘積

文獻(xiàn)［27］采用基于 B 3樣條（［1，4，6，4，1］/16）的à trous小波對原圖像I進(jìn)行K層多尺度分解，得到細(xì)節(jié)圖像（detail image）Wk（i=1，…，K）和近似圖像（approximation image）IK，有

式中，Ik是Ik－1與B3樣條逐行逐列卷積的結(jié)果。每層卷積過后B3樣條相鄰元素間要插入2k－1－1個(gè)0以適應(yīng)下一個(gè)尺度的計(jì)算。Wk（k=1，…，K）通過計(jì)算其中值絕對偏差（median absolute deviation，MAD）進(jìn)行自適應(yīng)閾值化得到去噪的～Wk，再將K個(gè)尺度的～Wk相乘（wavelet multiscale product，WMP）得到檢測目標(biāo)增強(qiáng)圖像C最后通過灰度閾值化提取目標(biāo)。

（2）多尺度方差穩(wěn)定變換

文獻(xiàn)［35］在文獻(xiàn)［29］基礎(chǔ)上針對熒光顯微圖像包含Poisson型噪聲，提出多尺度方差穩(wěn)定變換（multiscale variance stabilizing transform，MSVST），對WMP進(jìn)行了改進(jìn)，主要的改進(jìn)有3點(diǎn)：1）將原圖像I通過VST處理；2）通過控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）進(jìn)行Wk閾值操作；3）用混合最速下降（hybird steepest descent，HSD）迭代重構(gòu)圖像。該文還針對小波基在二維尺度上方向性不足引入脊波（ridgelet）和曲波（curvelet），改進(jìn)了MSVST。

除以上介紹的方法外，文獻(xiàn)［36］中介紹的KDE、LC、LEF、SE等方法在特定的場合也得到了應(yīng)用。文獻(xiàn)［37-38］中提出的Ada-Boost和Fisher判別分析這類機(jī)器學(xué)習(xí)方法，用于目標(biāo)檢測也取得了不錯(cuò)的效果，但需要在注釋過的訓(xùn)練樣本中學(xué)習(xí)得到目標(biāo)的特征，再利用提取的特征檢測目標(biāo)。由于生物圖像的復(fù)雜性，構(gòu)建合適的訓(xùn)練樣本集是困難的。

3.3 信號(hào)閾值化

為了從增強(qiáng)過的圖像中得到斑點(diǎn)的像素級信息，需要引入閾值化操作。先將目標(biāo)增強(qiáng)圖像C經(jīng)過灰度閾值ld得到二值圖像CB，利用CB作為掩模在原始圖像中標(biāo)記目標(biāo)并做亮度分析，可得到斑點(diǎn)的整體亮度、平均亮度、面積、周長、圓度、長短軸長、質(zhì)心等定量數(shù)據(jù)。由于灰度閾值對目標(biāo)的提取影響較大，所以使用尺寸閾值vd=（vmax，vmin）加以約束。只有當(dāng)圖像中尺寸大于最小閾值vmin且小于最大閾值vmax的點(diǎn)集才被認(rèn)為是檢測到的斑點(diǎn)。由于圖像噪聲并沒有被完全去除，閾值化得到的掩模圖像CB點(diǎn)集區(qū)域的非零像素點(diǎn)并不完全相連，點(diǎn)集中包含有錯(cuò)誤的零像素點(diǎn)，這個(gè)問題可以使用形態(tài)學(xué)閉運(yùn)算解決［11，34］。

4 檢測方法的性能評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

評價(jià)各類檢測方法的性能首先需要知道圖像中斑點(diǎn)的位置、個(gè)數(shù)、面積大小等信息的真實(shí)參考（ground truth）。這些只能靠生物學(xué)家人工分析顯微圖像獲得，也就是金標(biāo)準(zhǔn)（gold standard）。當(dāng)圖像的真實(shí)參考已知時(shí)，對檢測結(jié)果的真陽性（true positive，表示檢測結(jié)果符合生物學(xué)意義）、假陽性（false positive，表示檢測結(jié)果不符合生物學(xué)意義）、假陰性（false negative，表示未被檢測出的符合生物學(xué)意義）、真陰性（true negative，表示未被檢測出的不符合生物學(xué)意義）可以很容易進(jìn)行判別。此時(shí)，有很多性能評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)存在［39-40］。這里介紹兩類常見的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：F-score和ROC曲線。

（1）F-score

結(jié)合陽性預(yù)測值PV+和真陽性率TPR定義的度量標(biāo)準(zhǔn)F-score為式中，PV+表示TP占檢測結(jié)果（TP+FP）的比例，TPR表示TP占真實(shí)參考（TP+FN）的比例，F(xiàn)-score可更全面地評價(jià)目標(biāo)檢測性能，值越大性能越好。

（2）ROC曲線

接收者工作特性曲線（receiveroperating characteristic curve，ROC curve）是以假陽性率FPR（FP占FP+TN的比例）為橫坐標(biāo)，真陽性率TPR為縱坐標(biāo)，橫軸和縱軸的長度相等，形成正方形，在圖中將ROC工作點(diǎn)標(biāo)出，用直線連接各相鄰兩點(diǎn)構(gòu)建的非光滑曲線。理論上，當(dāng)檢測結(jié)果完全沒有意義時(shí)，有TPR=FPR，是一條從原點(diǎn)到右上角的對角線，稱為機(jī)會(huì)線（chance line）。ROC曲線一般位于機(jī)會(huì)線的上方，離機(jī)會(huì)線越遠(yuǎn)，說明檢測準(zhǔn)確度越高。最好的檢測方法表現(xiàn)為ROC曲線從原點(diǎn)垂直上升至左上角，然后水平到達(dá)右上角。ROC曲線下的面積AROC也可以反映檢測方法的性能，取值范圍為（0.5，1），完全沒有價(jià)值的檢測AROC=0.5，完全理想的檢測AROC=1。一般認(rèn)為AROC在0.5到0.7之間表示檢測準(zhǔn)確性較低，0.7到0.9時(shí)準(zhǔn)確性中等，大于0.9準(zhǔn)確性較高［41］。

5 總結(jié)展望

本文所介紹的亞細(xì)胞斑點(diǎn)檢測方法都是針對特定應(yīng)用場合設(shè)計(jì)的，具體方法需要根據(jù)不同的應(yīng)用背景進(jìn)行合理的選擇。其中，由于計(jì)算簡便被廣泛使用的SEF和GOTH，需要通過信號(hào)閾值化操作得到斑點(diǎn)的二值掩模圖像標(biāo)記原圖像，以此進(jìn)行后續(xù)的像素級信息統(tǒng)計(jì)，所以對噪聲和閾值的選取比較敏感；SPL、FPD和H-Dome是為目標(biāo)追蹤問題而設(shè)計(jì)的，只考慮檢測斑點(diǎn)的位置信息，不需要通過信號(hào)閾值化操作提取檢測目標(biāo)，其中FPD和HDome因?yàn)榧尤虢Y(jié)果判別準(zhǔn)則，有效地提高了檢測準(zhǔn)確度；WMP和MSVST都隱式含有濾波處理，不需要額外的濾波操作，提取目標(biāo)雖然不需要尺寸閾值化，但都包含灰度閾值化操作，其中MSVST對于處理Poisson-Gaussian混合噪聲效果顯著；RMPTH和SPL得益于直線片段結(jié)構(gòu)元素和Gaussian迭代擬合，能夠檢測出粘連的斑點(diǎn)；H-Dome和MSVST算法復(fù)雜度較高，可用于信噪比極低的圖像數(shù)據(jù)，文獻(xiàn)［42］的結(jié)論表明在測試數(shù)據(jù)中，當(dāng)信噪比小于2時(shí)，H-Dome和MSVST檢測仍然有效且效果不相上下。

雖然現(xiàn)代光學(xué)顯微成像技術(shù)已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的尺寸（約幾個(gè)nm）相比，目前最先進(jìn)顯微鏡的分辨率（約100 nm）仍然很低［43-44］。除了成像過程引入的固有噪聲，染料選取、染色方式以及顯微鏡操作不當(dāng)，都會(huì)造成采集到的圖像信噪比較低、均一度差。在這種情況下，即使專業(yè)的生物學(xué)家將目標(biāo)從噪聲和不相關(guān)背景中區(qū)分開也是相當(dāng)困難的。在序列成像過程中，上述問題更為嚴(yán)重。除了問題本身的難度，現(xiàn)有方法的瓶頸在于只適用某種成像條件或某種細(xì)胞器類型，研究者無法全面了解問題，所提出方法的通用性受到了很大的限制。導(dǎo)致目前各種算法實(shí)用性不強(qiáng)的共性難點(diǎn)有：（1）現(xiàn)有內(nèi)置或外在的濾波技術(shù)很難完全去除復(fù)雜的噪聲干擾，對后續(xù)操作影響較大；（2）每種算法針對不同圖像都有多個(gè)與檢測目標(biāo)密切相關(guān)的參數(shù)需要設(shè)置，不能做到自適應(yīng)調(diào)節(jié)；（3）缺乏可靠的檢測結(jié)果評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，方法間不能客觀地進(jìn)行比較。這些都給用戶選擇合適的方法帶來了巨大困難。

總之，要解決目前熒光顯微圖像目標(biāo)檢測中存在的問題，與成像技術(shù)的發(fā)展和數(shù)據(jù)產(chǎn)生的速度相適應(yīng)，需要在每個(gè)環(huán)節(jié)上有所創(chuàng)新和突破。首先，建立全面可靠的基準(zhǔn)測試庫。目前科研人員已經(jīng)開始著手收集細(xì)胞和各類生物樣本的基準(zhǔn)測試圖樣，對檢測方法進(jìn)行比較和檢驗(yàn)［45-47］。其次，采用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法針對特定目標(biāo)樣本圖像訓(xùn)練得到自適應(yīng)的算法參數(shù)。最后，提出更能客觀反映算法性能的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，并以此為依據(jù)研究魯棒性和通用性更強(qiáng)的新方法。

［1］Lippincott-Schwartz J，Patterson GH.Development and use of fluorescent protein markers in living cells［J］.Science，2003，300（5616）：87-91.

［2］Miyawaki A，Sawano A，Kogure T.Lighting up cells：Labelling proteins with fluorophores［J］.Nature Cell Biology，2003，5（Suppl）：1-7.

［3］Stephens DJ，Allan VJ.Light microscopy techniques for live cell imaging［J］.Science，2003，300（5616）：82-86.

［4］Tsien RY.Imagining imaging’s future［J］.Nature Cell Biology，2003，5（Suppl）：16-21.

［5］Pepperkok R，Ellenberg J.High throughputfluorescence microscopy for systems biology［J］.Nature Reviews Molecular Cell Biology，2006，7（9）：690-696.

［6］Vonesch C，Aguet F，Vonesch JL，et al.The colored revolution of bioimaging［J］.IEEE Signal Processing Magazine，2006，23（3）：20-31.

［7］Eils R，Athale C.Computational imaging in cell biology［J］.The Journal of Cell Biology，2003，161（3）：477-481.

［8］Zhou X，Wong STC.Informatics challenges of high throughput microscopy［J］.IEEE Signal Processing Magazine，2006，23（3）：63-72.

［9］Shorte SL，F(xiàn)rischknecht F.Imaging Cellular and Molecular Biological Functions［M］.Berlin：Springer-Verlag，2007：45-70.

［10］Ahmed WM，Leavesley SJ，Rajwa B，et al.State of the art in information extraction and quantitative analysis for multimodality biomolecular imaging［J］.Proceedings of the IEEE，2008，96（3）：512-531.

［11］WuQ，MerchantFA，Castleman KR.MicroscopeImage Processing［M］.Burlington：Elsevier，2008：247-297.

［12］Drubin DA，Garakani AM，Silver PA.Motion as a phenotype：The use of live-cell imaging and machine visual screening to characterize transcription dependent chromosome dynamics［J/OL］.BMC CellBiology，2006，7（19）.http：//www.biomedcentral.com/1471-2121/7/19，2006-04-24/2012-07-18.

［13］Neumann B，Held M，Liebel U，et al.High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells［J］.Nature Methods，2006，3（5）：385-390.

［14］Sacher R，Stergiou L，Pelkmans L.Lessons from genetics：interpreting complex phenotypes in RNAi screens［J］.Current Opinion Cell Biology，2008，20（4）：483-489.

［15］Khodade P，Malhotra S，Kumar N，etal.Cytoview：development of a cell modelling framework［J］.Journal of Bioscience，2007，32（5）：965-977.

［16］Jaqaman K，Loerke D，Mettlen M，et al.Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences［J］.Nature Methods，2008，5（8）：695-702.

［17］Sbalzarini IF，Koumoutsakos P.Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology［J］.Journal of Structure Biology，2005，151（2）：182-195.

［18］Smal I，Meijering E，Draegestein K，et al.Multiple object tracking in molecular bioimaging by rao-blackwellized marginal particle filtering［J］.Medical Image Analysis，2008，12（6）：764-777.

［19］Dorn JF，Danuser G，Ge Y.Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data［J］.Methods in Cell Biology，2008，25：497-538.

［20］Gerlich D，Ellenberg J.4D imaging to assay complex dynamics in live specimens［J］.Nature Cell Biology，2003，5（Suppl）：14-19.

［21］MeijeringE，SmalI，DanuserG.Tracking in molecular bioimaging［J］.IEEE Signal Processing Magazine，2006，23（3）：46-53.

［22］Stevens JK，Mills LR，Trogadis JE.Three Dimensional Confocal Microscopy：Volume Investigation of Biological Specimens［M］.London：Academic Press，1994：47-93.

［23］Zhang B，Zerubia J，Olivo-Marin J-C.Gaussian approximations of fluorescence microscope point spread function models［J］.Applied Optics，2007，46（10）：1819-1829.

［24］Thomann D，Rines DR，Sorger PK，et al.Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution：Application to the analysis of chromosome movement［J］.Journal of Microscopy，2002，208（1）：49-64.

［25］RomenyTHBM.Front-End Vision and Multi-Scale Image Analysis［M］.Berlin：Springer，2003：277-284.

［26］Turin GL.An introduction to matched filters ［J］.IRE Transactions on Information Theory，1960，6（3）：311-329.

［27］Olivo-Marin J-C.Extraction of spots in biological images using multiscale products［J］.Pattern Recognition，2002，35（9）：1989-1996.

［28］Boulanger J，Kervrann C，Bouthemy P.Patch-based nonlocal functional for denoising fluorescence microscopy image sequences［J］.IEEE Transactions on Medical Imaging，2010，29（2）：442-454.

［29］Zhang B，F(xiàn)adili J，Starck JL.Multiscale variance-stabilizing transform for mixed-Poisson-Gaussian processes and its applications in bioimaging ［C］.Proceedings of IEEE International Conference on Image Processing.San Antonio：IEEE，2007，6（Ⅵ）：233-236.

［30］KimoriY，Baba N，Morone N.Extended morphological processing：a practical method for automatic spot detection of biological markers from microscopic images［J/OL］.BMC Bioinformatics，2010，11（373）.http：//www.biomedcentral.com/1471-2105/11/373，2010-07-08/2012-07-18.

［31］RohrK，GodinezWJ，HarderN，etal.Tracking and quantitative analysis of dynamic movements of cells and particles［J/OL］.Cold Spring Harb Protocols，2010，6：1-16.http：//cshprotocols.cshlp.org/content/2010/6/pdb.top80.full，2010-06-01/2012-07-18.

［32］Sage D，Neumann FR，Hediger F，et al.Automatic tracking of individual fluorescence particles：Application to the study of chromosome dynamics ［J］.IEEE Transactionson Image Processing，2005，14（9）：1372-1383.

［33］Crocker JC，Grier DG.Methods of digital video microscopy for colloidal studies［J］.Journal of colloid and interface science，1996，179：298-310.

［34］Soille P.Morphological Image Analysis：Principles and Applications［M］.Berlin：Springer-Verlag，2003：121-127.

［35］Zhang B，F(xiàn)adili J，Starck J.Wavelets，ridgelets，and curvelets for Poisson noise removal［J］.IEEE Transactions on Image Processing，2008，17（7）：93-108.

［36］Ruusuvuori P，?ij? T，Chowdhury S，et al.Evaluation of methods for detection of fluorescence labeled subcellular objects in microscope images［J/OL］.BMC Bioin for matics，2010，11（248）.http：//www.biomedcentral.com/1471-2105/11/248，2010-05-13/2012-07-18.

［37］Jiang S，Zhou X，Kirchhausen T，et al.Detection of molecular particles in live cells via machine learning［J］.Cytometry A，2007，71（8）：563-575.

［38］Mclachlan GJ.Discriminant Analysis and Statistical Pattern Recognition［M］.New York：Wiley，2004：129-336.

［39］Fawcett T.An introduction to ROC analysis［J］.Pattern Recognition Letters，2006，27：861-874.

［40］Popovic A，De La Fuente M，Engel hardt M，et al.Statistical validation metric for accuracy assessment in medical image segmentation［J］.International Journal of Computer Assisted Radiology and Surgery，2007，2：169-181.

［41］Swets JA.Measuring the accuracy of diagnostic systems［J］.Science，1988，240：1285-1293.

［42］Smal I，Loog M，Niessen W，et al.Quantitative comparison of spot detection methods in fluorescence microscopy［J］.IEEE Transactions on Medical Imaging，2010，29（2）：282-301.

［43］Hell SW，Dyba M，Jakobs S.Concepts for nanoscale resolution in fluorescence microscopy［J］.Current Opinion in Neurobiology，2004，14（5）：599-609.

［44］Garini Y，Vermolen BJ，Young IT.From micro to nano：Recent advances in high-resolution microscopy［J］.Current Opinion in Neurobiology，2005，16（1）：3-12.

［45］Ruusuvuori P，Lehmussola A，Selinummi J，et al.Benchmark set of synthetic images for validating cellimage analysis algorithms［C］//Proceedings of the 16th European Signal Processing Conference.Lausanne： EUSIPCO，2008：1569105508.

［46］Broad bioimage benchmark collection［DB/OL］.http：//www.broad.mit.edu/bbbc，2012-05-21/2012-07-18.

［47］Gelasca ED，Byun J，Obara B，et al.Evaluation and benchmark for biological image segmentation［C］//Proceedings of IEEE International Conference on Image Processing.San Diego：IEEE，2008：1816-1819.