新型醛基化海藻酸鈉抗凝血涂層物制備及性能評(píng)價(jià)

李金友 李 彤 高文卿 于美麗 胡曉旻 許 晉 陸海濱 于廣棟

（天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300170）2（天津市第三中心醫(yī)院，天津 300170）3（天津市人工細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300170）

引言

隨著體外循環(huán)技術(shù)的發(fā)展，體外循環(huán)管路的血液相容性和生物相容性受到了醫(yī)學(xué)界的高度重視。自發(fā)現(xiàn)肝素涂層人工材料表面能夠改善材料的抗凝性能和生物相容性，并具有減少體外循環(huán)肝素化肝素用量、降低輸血率和減少并發(fā)癥等優(yōu)點(diǎn)以來［1-3］，各種肝素涂層方法不斷涌現(xiàn)，主要分物理纏繞和化學(xué)固定兩大類，目前應(yīng)用較廣的是通過終點(diǎn)固定法結(jié)合肝素［4］。終點(diǎn)固定法肝素涂層管路有著良好的抗凝血性能，但是由于肝素原料及進(jìn)口套包價(jià)格昂貴，在一定程度上限制了其應(yīng)用。

海藻酸鈉是一種聚陰離子大分子多糖，具有良好的生物相容性和一定的抗凝性能［5］，價(jià)格低廉容易獲得，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)材料和生物工程方面［6，7］。本研究通過高碘酸鈉氧化獲得多醛基的OSA，利用終點(diǎn)固定法將OSA涂層物固定到體外循環(huán)用PVC管道內(nèi)表面（PVCS），對(duì)OSA涂層管道進(jìn)行生物相容性和血液相容性評(píng)價(jià)，并與美敦力肝素涂層組（PVCM）、空白對(duì)照組（PVCC）進(jìn)行比較，以期獲得具備優(yōu)異生物相容性和良好抗凝性能的新型OSA涂層管路。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

材料：BCA蛋白試劑盒（CAS：120509，上海生工），人血清白蛋白（10 g/50 mL，Behring GmbH，德國(guó)），人血清纖維蛋白原（CAS：9001-32-5，Calbiochem，德國(guó)），海藻酸鈉（CAS：9005-38-3，SIGMA-ALDRICH，美國(guó)）高碘酸鈉（CAS：7790-28-5，SIGMA-ALDRICH，美國(guó)）。

儀器：紅外分光光度計(jì)（NICOLET 6700，Thermo，美國(guó)），紫外分光光度計(jì)（UV-2800，日立，日本），凝血自動(dòng)分析儀（STA-R Evolution?，Diagnostica Stago，法 國(guó)），血細(xì)胞分析儀（ADVIA2120，SIEMENS，德國(guó)），掃描電鏡（FEI臺(tái)式，美國(guó)）

1.2 方法

1.2.1 OSA的制備及氧化度測(cè)定

1.2.1.1 海藻酸鈉氧化處理

依照文獻(xiàn)［8］方法，制備 OSA。配質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的海藻酸鈉水溶液100 mL，然后按不同摩爾比（1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶10、1∶12）加入高碘酸鈉，避光磁力攪拌下反應(yīng)24 h，然后加入0.4 mL乙二醇終止反應(yīng)15 min，終止液加入4 g NaCl，混勻5 min，按體積比1∶5倒入無水乙醇中沉淀、析出，將沉淀物取出，真空抽吸，自然干燥。干燥后樣品再溶，后透析過夜，透析后樣品液經(jīng)冷凍干燥后得終產(chǎn)物OSA。

1.2.1.2 海藻酸鈉24 h氧化度測(cè)定

按文獻(xiàn)［9］，采用碘化鈉-淀粉糊精法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取氧化24 h的海藻酸鈉溶液2.5 mL，迅速加入工作液2.5 mL，避光作用50 min后在480 nm處測(cè)定吸光度值，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出高碘酸鈉消耗量。

式中，N為高碘酸鈉消耗量（mol），M0為樣品質(zhì)量（g），198為海藻酸鈉單元分子量（g/mol）。

1.2.2 體外循環(huán)PVC管路表面涂層物的固定

1.2.2.1 體外循環(huán)PVC管路表面預(yù)處理及修飾

取內(nèi)表面積為50 cm2的普通PVC管，放入預(yù)配好的高錳酸鉀濃硫酸溶液，酸化處理5 min；蒸餾水沖洗經(jīng)酸化處理后的PVC管；將酸化處理后的PVC管放入不同濃度聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）溶液中，pH調(diào)到9，常溫下進(jìn)行氨基化修飾，修飾時(shí)間20 min；蒸餾水充分沖洗，獲得不同PEI濃度條件下制備出的氨基化修飾的PVC管。

1.2.2.2 OSA涂層物的終點(diǎn)固定

配制不同濃度的 OSA溶液500 mL，將 OSA溶液pH調(diào)到不同值，并將OSA溶液倒入表面修飾后的PVC管路中，兩端封閉，在不同溫度下水浴2 h。最終制備出不同條件下OSA涂層的PVC管路。

1.2.3 OSA涂層物密度測(cè)定

按文獻(xiàn)［10］方法建立多糖定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。取OSA涂層管路反應(yīng)后溶液2 mL加入1 mL苯酚，再迅速加入5 mL濃硫酸，沸水浴15 min，然后取出容量瓶自然冷卻，取反應(yīng)液在630 nm處測(cè)吸光度值，將反應(yīng)前后吸光度值代入多糖定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，算出反應(yīng)前后OSA濃度差值，并計(jì)算涂層管路內(nèi)表面OSA涂層密度。

涂層密度 =（反應(yīng)前濃度-反應(yīng)后濃度）×

1.2.4 OSA涂層最佳條件篩選

1.2.4.1 OSA最佳氧化度的篩選

在其他反應(yīng)條件不變的情況下，選用高碘酸鈉和海藻酸鈉摩爾比為1∶8、1∶10和1∶12制備的 OSA進(jìn)行涂層，并分別編號(hào)為PVCSH、PVCSM和PVCSL組。計(jì)算3組涂層密度并進(jìn)行比較，以期獲得涂層效果最佳的氧化度。

1.2.4.2 OSA涂層PVC管路最佳條件的篩選

利用正交設(shè)計(jì)的方法，將酸的濃度、PEI濃度、OSA溶液濃度、OSA溶液pH值和溫度作為5種因素，每種因素3個(gè)水平：酸的濃度分別為40％、50％和70％；PEI濃度分別為 0.05、0.1和0.5 mg/mL；OSA溶液濃度分別為0.1、0.5和2 mg/mL；pH值分別為3.5、6和9；溫度分別為30℃、40℃和50℃；通過SPSS17.0生成正交表；按生成的正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并重復(fù)3次，采用硫酸-苯酚法定量涂層的密度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，篩選最佳涂層條件。

1.2.5 涂層表面血液凝固時(shí)間測(cè)定

評(píng)價(jià)指標(biāo)包括部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶原時(shí)間（PT）、凝血酶時(shí)間測(cè)定（TT）和FT（纖維蛋白原時(shí)間）。方法為剪10 cm2的樣管，置于24孔板中并用生理鹽水常溫下浸泡1 h；取健康自愿者血液，在3 500 r/min條件下離心15 min，得到貧血小板血漿（PPP），測(cè)定孵育前 PPP凝血4項(xiàng)值；吸凈24孔板中生理鹽水，加入 PPP 750 μL，置于37℃水浴箱內(nèi)孵育1 h，抽取孵育后的血漿，測(cè)定反應(yīng)后凝血4項(xiàng)的值。

1.2.6 涂層表面蛋白吸附實(shí)驗(yàn)

按試劑盒方法建立BCA法蛋白粘附的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定各組人血清白蛋白和纖維蛋白粘附量并進(jìn)行對(duì)比分析。

依照文獻(xiàn)［11］的方法，配制200 μg/mL的蛋白工作液，然后將10 cm2的樣管加入到24孔板中，加入蛋白工作液1.5 mL，37 ℃下反應(yīng)1 h，取100 μL待測(cè)反應(yīng)液加1 mL BCA工作液，迅速混勻，60℃水浴30 min后于562 nm處測(cè)吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)前后蛋白濃度差值，得到蛋白粘附密度。

1.2.7 涂層表面血小板粘附評(píng)價(jià)

依照文獻(xiàn)［12］，取健康志愿者血漿，將新鮮血漿在800 r/min條件下，離心10 min，取上層血漿，得到富血小板血漿（PRP），測(cè)定反應(yīng)前PRP血小板值PLT1；剪10 cm2的樣管，置于 24孔板中，加入 PRP 500 μL，于37 ℃ 孵育1 h，取出孵育后的 PRP，并測(cè)定血小板值 PLT2，然后計(jì)算反應(yīng)前后血小板的差值。

1.2.8 表面血栓形成實(shí)驗(yàn)

按文獻(xiàn)［13］的方法，將10 cm2的樣管沖洗3次后放于24孔板中，真空干燥并稱重編號(hào)W1，取健康志愿者新鮮全血1.5 mL加入到24孔板中，在37℃下孵育30 min，取出樣管，PBS沖洗3次，沖去表面粘附不牢固的血栓，真空干燥，稱重W2，計(jì)算反應(yīng)前后的差值。

血栓粘附量（mg）=W1-W2（6）

1.2.9 PVCS和PVCM脫落率測(cè)定

將制備好的長(zhǎng)為1 m的PVCS管路連接到ECMO上，流量控制為2.4 L/min，轉(zhuǎn)流72 h，分別在 0.5、1、2、4、8、12、24、48、72 h，取轉(zhuǎn)流液體，用硫酸苯酚法測(cè)得轉(zhuǎn)流液中OSA濃度，并計(jì)算相對(duì)應(yīng)時(shí)間的PVCS中OSA脫落率，，并重復(fù)3次。同時(shí)用同樣的方法將PVCM連接到ECMO上，同樣的條件轉(zhuǎn)流72 h，并在相同的時(shí)間點(diǎn)取轉(zhuǎn)流液，用甲苯胺藍(lán)法測(cè)轉(zhuǎn)流液中肝素濃度，并計(jì)算PVCM中肝素脫落率。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢驗(yàn)

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，結(jié)果采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行分析，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)P ＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 海藻酸鈉氧化度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1 海藻酸鈉氧化度標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立方法，計(jì)算得海藻酸鈉氧化度標(biāo)準(zhǔn)曲線：

2.1.2 海藻酸鈉氧化度

由圖1可見，隨著高碘酸鈉摩爾比例的增加，氧化度逐漸增加，梁曄等報(bào)道，當(dāng)海藻酸鈉氧化度較高（47％）時(shí)，大劑量的OSA對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出較明顯的抑制作用，且隨著氧化度的增加，細(xì)胞毒性也隨著增加；但中等氧化度（24％）和低氧化度的OSA就表現(xiàn)出良好的生物相容性，細(xì)胞毒性較低，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯抑制作用［14］，與Gao等報(bào)道的氧化度小于30％的時(shí)候，具有非細(xì)胞毒性結(jié)果［15］相一致，故采用低氧化度的OSA作為反應(yīng)原料。

2.2 多糖定量標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法，得多糖定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

圖1 海藻酸鈉24 h氧化度Fig.1 The 24 hours oxidation degree of sodium alginate

2.3 最佳涂層條件篩選

2.3.1 OSA最佳氧化度的篩選

各級(jí)各有關(guān)部門始終把人民群眾的生命安全放在首位，及時(shí)發(fā)布洪水預(yù)警，全面排查危險(xiǎn)地區(qū)群眾，提前轉(zhuǎn)移受洪水威脅人員，有效保障了群眾生命安全。災(zāi)區(qū)各級(jí)政府多方籌集資金，加大安置和救濟(jì)工作力度，保障了受災(zāi)群眾基本生活。針對(duì)房屋損毀多、洪水時(shí)間長(zhǎng)的實(shí)際困難，黑龍江省強(qiáng)化受災(zāi)群眾集中安置與投親靠友安置，全力推進(jìn)房屋修繕重建，確保群眾安全溫暖過冬，幫助群眾盡快返遷。由于“以人為本”始終貫穿于各個(gè)工作環(huán)節(jié)，大江大河洪水未造成一人死亡，災(zāi)區(qū)社會(huì)和諧穩(wěn)定。

計(jì)算3種氧化度OSA的涂層密度，結(jié)果如表1。PVCSM和PVCSL組相比，前者OSA涂層密度顯著大于后者（P=0.019）；PVCSM與PVCSH組相比，前者OSA涂層密度顯著大于后者（P=0.029）；PVCSL和PVCSH組相比，OSA涂層密度無顯著差異（P=0.926）；故本實(shí)驗(yàn)采用氧化度為9.65％的OSA作為涂層材料。

表1 不同組涂層密度Tab.1 The coating density of different groups

2.3.2 OSA涂層PVC管路最佳條件的篩選

重復(fù)5因素3水平正交試驗(yàn)3次，結(jié)果如表2所示。根據(jù)分析結(jié)果結(jié)合試驗(yàn)條件篩選出最佳涂層條件為50％的濃硫酸、0.05％的PEI、反應(yīng)溶液pH3.5、反應(yīng)溫度為50℃和OSA濃度為2 mg/mL，測(cè)試管路涂層效果、血液相容性和生物相容性均以最優(yōu)條件涂層的管路作為樣品。

表2 正交實(shí)驗(yàn)中各組涂層密度Tab.2 The coating density of different groupsin the orthogonal table

2.4 涂層表面凝血功能

各組反應(yīng)后凝血4項(xiàng)的值見表3。PVCS組PT和APTT延長(zhǎng)時(shí)間均顯著長(zhǎng)于PVCC組（P＜0.05），但均劣于PVCM組（P＜0.05）；PVCS組TT和FT延長(zhǎng)時(shí)間均顯著長(zhǎng)于PVCC組（P＜0.05）和PVCM組（P＜0.05）。如圖2所示。提示PVCS組有良好的抗凝效果。

表3 不同分組的涂層管路抗凝血結(jié)果Tab.3 The anticoagulant results of different groups

圖2 各組抗凝血指標(biāo)柱形圖Fig.2 The anticoagulant indicators of different groups

2.5 涂層表面蛋白吸附

2.5.1 蛋白粘附的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線制定方法，制定蛋白吸附標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

2.5.2 涂層表面蛋白粘附量

計(jì)算蛋白粘附量得表4，結(jié)果提示PVCS組人血清白蛋白粘附量顯著少于 PVCC組（P=0.000）和PVCM組（P=0.002）。PVCM組人血清白蛋白粘附量顯著少于PVCC組（P=0.002）。纖維蛋白粘附試驗(yàn)與人血清白蛋白粘附試驗(yàn)結(jié)果相似，PVCS組纖維蛋白粘附量顯著少于PVCC組（P=0.000）和PVCM組（P=0.029）；PVCM組纖維蛋白粘附量顯著少于PVCC組（P=0.000）。涂層表面蛋白粘附量結(jié)果表明PVCS組具有良好的生物相容性。

2.6 涂層表面血小板粘附

表5結(jié)果提示PVCS與PVCC組相比，血小板粘附量顯著減少（P＜0.05）；PVCS與PVCM相比，無顯著差異（P＞0.05）；PVCM組與PVCC組相比，血小板粘附量顯著減少（P＜0.05）。提示PVCS和PVCM能夠減少血小板的粘附，此結(jié)果可以在電鏡下得到佐證，見圖 3。

表4 不同組蛋白吸附量Tab.4 The protein adhesion amount of different groups

表5 不同組的血小板粘附結(jié)果Tab.5 The platelet adhesion results of different groups

由圖3（a）可以看出，PVCC組管路表面均粘附了較多的血小板及其碎片，并有血小板出現(xiàn)形態(tài)學(xué)的改變；而在PVCS組（圖3（b））和 PVCM 組（圖3（c）），電鏡下血小板粘附量明顯減少。提示PVCS組和PVCM具有良好的抗血小板粘附的能力。

2.7 涂層表面血栓形成

計(jì)算血栓形成實(shí)驗(yàn)前后干重差值，如表6所示，提示PVCS組與PVCC組相比，血栓形成顯著減少（P＜0.05），PVCS組與PVCM組相比，無顯著差異（P＞0.05）。PVCM與PVCC組相比，血栓顯著減少（P＜0.05）。提示PVCS和PVCM組都能有效的減少血栓形成，都具有良好的血液相容性。

2.8 PVCS和PVCM脫落率

通過計(jì)算得到，PVCM 組在 0.5、1、2、4、8、12、24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)上的脫落率均值，依次為0.08％、0.22％、0.53％、0.86％、1.23％、1.32％、1.33％、1.33％和1.34％，可見隨著時(shí)間的延長(zhǎng)PVCM中肝素緩慢脫落到8 h的時(shí)間點(diǎn)基本趨于穩(wěn)定。而PVCS組在相同時(shí)間點(diǎn)上的脫落率均值分別為0.22％、0.52％、0.83％、1.26％、2.73％、3.2％、3.4％、3.5％和3.5％；由上可見，PVCS中OSA脫落率較PVCM中肝素脫落率稍高，但與PVCM有著相同的脫落趨勢(shì)。OSA涂層物脫落在第12 h趨于穩(wěn)定，能夠滿足短期體外循環(huán)的要求，結(jié)果如圖4所示。

圖3 不同分組電鏡下血小板粘附（5 000×）。（a）PVCC；（b）PVCS；（c）PVCMFig.3 The platelet adhesion of different groups under the electron microscopy（5 000 ×）.（a）PVCC；（b）PVCS；（c）PVCM

表6 血栓形成密度Tab.6 The density of thrombosis

3 討論和結(jié)論

本研究應(yīng)用低氧化度的OSA作為涂層材料，通過最佳涂層條件的篩選試驗(yàn)證明，OSA涂層物能夠固定在PVC管路表面。

圖4 PVCS和PVCM脫落率Fig.4 The expulsion rate of PVCS and PVCM

凝血功能試驗(yàn)，PT反映外源性凝血系統(tǒng)，APTT反應(yīng)內(nèi)源性凝血系統(tǒng)，PVCS組PT和APTT時(shí)間均顯著延長(zhǎng)，顯示了良好的抑制內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng)的效果，TT和FT均反映凝血系統(tǒng)的白血栓的形成，PVCS組TT和FT時(shí)間均顯著延長(zhǎng)，說明PVCS組能夠抑制血栓的形成，這與Andersson［16］等報(bào)道相一致。

蛋白粘附試驗(yàn)結(jié)果表明，PVCS組抗蛋白粘附的效果優(yōu)于PVCM，體現(xiàn)了PVCS優(yōu)越的生物相容性，這也提示PVCS組能夠彌補(bǔ)肝素生物相容性稍差的不足。

血小板粘附試驗(yàn)結(jié)果提示PVCS與PVCM均具有良好的抗血小板粘附的作用，體現(xiàn)了兩組管路良好的血液相容性，這個(gè)試驗(yàn)結(jié)果與Manju等研究結(jié)果［17］相吻合。血栓形成試驗(yàn)也證明PVCS組具有減少血栓形成的作用。

盡管PVCS組脫落率稍高于于PVCM組，但是完全能夠滿足短期的體外循環(huán)支持的心外手術(shù)。若PVCS組管路代替心外手術(shù)體外循環(huán)應(yīng)用的未涂層PVC管路，理論上可以起到減少血栓形成、降低肝素化的肝素用量、減少炎癥反應(yīng)和降低并發(fā)癥發(fā)生率的效果。此外，由于PVCS組制作成本較低，原材料獲取容易，適合臨床大范圍推廣甚至是常規(guī)應(yīng)用，為短期體外循環(huán)用管路提供了一個(gè)良好的思路。

本研究結(jié)果定量試驗(yàn)顯示PVCS組上有效的固定了OSA，而且其72 h內(nèi)的脫落率在3.5％左右，雖然稍高于PVCM組中肝素的脫落率，但是仍保持較低水平，顯示了較好的穩(wěn)定性。血液相容性試驗(yàn)顯示出PVCS組管路能夠起到良好的抗凝和減少血栓形成的效果，但是其性能與PVCM組相比稍差。生物相容性試驗(yàn)顯示出PVCS組管路能夠有效的減少人血清白蛋白和纖維蛋白的粘附，且其性能優(yōu)于PVCM組。綜合看PVCS組管路具有較好的穩(wěn)定性、優(yōu)越的生物相容性和較好的血液相容性，為體外循環(huán)用涂層管路，提供一個(gè)價(jià)格較為低廉的新的涂層材料。

［1］TagarakisGI，Tsilimingas NB.Heparin-coated extracorporeal circulation systems in heart surgery ［J］.Recent Pat Cardiovasc Drug Discov，2009，4（3）：177-179.

［2］Nozohoor S，Johnsson P，Scicluna S，et al.A case-controlled evaluation of the Medtronic Resting Heart System compared with conventional cardiopulmonary bypass in patients undergoing isolated coronary artery bypass surgery［J］.Interact Cardiovasc Thorac Surg，2012，14（5）：599-604.

［3］Ovrum E， Tangen G， T?ll?fsrud S， etal. Heparinized cardiopulmonary bypass circuits and low systemic anticoagulation：an analysis of nearly 6000 patients undergoing coronary artery bypass grafting［J］.Thorac Cardiovasc Surg，2011，141（5）：1145-1149.

［4］Nilsson UR，Larm O，Nilsson B，et al.Modification of the complement binding properties of polystyrene：effects of end-point heparinattachment.Scand J Immunol［J］.1993，37（3）：349-354.

［5］Nishino T， Yokoyama G， DobashiK， etal. Isolation，purification，and characterization offucose-containing sulfated polysaccharides from the brown seaweed Ecklonia kurome and their blood-anticoagulant activities［J］.Carbohydr Res，1989，186（1）：119-148.

［6］Bron JL，Vonk LA，Smit TH，et al.Engineering alginate for intervertebral disc repair［J］.Mech Behav Biomed Mater 2011，4（7）：1196-1205.

［7］Popa EG，Gomes ME，Reis RL.Cell delivery systems using alginate—carrageenan hydrogel beads and fibers for regenerative medicine applications ［J］.Biomacromolecules，2011，12（11）：3952-3961.

［8］Bouhadir KH，Lee KY，Alsberg E，et al.Degradation of partially oxidized alginate and its potential application for tissue engineering［J］.Biotechnol Prog，2001，17（5）：945-995.

［9］何淑蘭、張敏、耿占杰，等，部分氧化海藻酸鈉的制備與性能［J］.應(yīng) 用 化 學(xué)，2005，22（9）：1007-1011.

［10］鐘方曉、任海華、李巖.多糖含量測(cè)定方法比較［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥 2007，3（8）：1916-1917.

［11］Valdes TI，Ciridon W，Ratner BD，et al.Surface modification of a perfluorinated ionomer using a glow discharge deposition method to control protein adsorption ［J］.Biomaterials，2008，29（10）：1356-1366.

［12］Dhandayuthapani B，Varghese SH，Aswathy RG，et al.Evaluation ofAntithrombogenicity and Hydrophilicity on Zein-SWCNT Electrospun Fibrous Nanocomposite Scaffolds［J］.Int J Biomater，2012，2（8）：1155-1165.

［13］Weaver JD， Ku DN.Biomaterialtesting forcovered stent membranes：evaluating thrombosis and restenosis potential［J］.Biomed Mater Res B Appl Biomater，2012，100（1）：103-110.

［14］梁曄，劉萬(wàn)順，韓寶芹，等.一種新型生物交聯(lián)劑的制備及其性質(zhì)［J］.中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，38（4）：590-594.

［15］Gao Chunmei，Liu Mingzhu，Chen Jun，et al.Interactions between bovine serum albumin and oxidized sodium alginate in solution［J］.Biomater Sci Polym Ed，2011，22（12）：1639-1650.

［16］Andersson LO，Hoffman J，Holmer E，et al.Mechanisms of anticoagulant effects of some sulphated polysaccharides［J］.Thromb Res，1982，28（6）：741-748.

［17］Manju S，Muraleedharan CV，Rajeev A，et al.Evaluation of alginate dialdehyde cross-linked gelatin hydrogel as a biodegradable sealant for polyester vascular graft［J］.Biomed Mater Res B Appl Biomater，2011，98（1）：139-149.