NLRP3炎性體信號通路在急性痛風性關節(jié)炎患者中的變化研究

宋先東+李揚+劉波+閆昭威+孫繼平+朱敏

[摘要] 目的 探討NLRP3炎性體信號通路在急性痛風性關節(jié)炎患者中的變化。 方法 選取來我院就診的360例患者作為研究對象。設置3個實驗，分別為蛋白質免疫印跡實驗、酶聯(lián)免疫吸附測定實驗和關節(jié)滑膜免疫組化實驗。每個實驗設6組對照實驗（正常組，模型組，秋水仙堿陽性藥組及GT低、中、高劑量組），每組20例患者。取樣觀察患者關節(jié)滑膜組織，檢測白細胞介素-6（IL-6），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及Nod樣受體蛋白3（NLRP3）炎性體的表達，分析測定平均積分吸光度（IA）。 結果 治療前后對比發(fā)現(xiàn)GT中、高劑量組的NLRP3的表達水平降低（P<0.05），GT各組IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB表達均明顯降低（P<0.05）。 結論 使用GT和秋水仙堿治療急性痛風性關節(jié)炎時可能會降低NLRP3炎性體信號通路中炎性因子的表達，對患者體內的NF-κB的活化和IL-1β 分化成熟也會有一定的影響。

[關鍵詞] NLRP3；急性痛風性關節(jié)炎；桂枝芍藥知母湯煎劑；抗炎免疫

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）17-0015-03

[Abstract] Objective To investigate the changes of NLRP3 inflammatory signaling pathway in patients with acute gouty arthritis. Methods A total of 360 patients admitted in our hospital were selected as the research objects. Three experiments were performed， including protein immunoblotting experiment， enzyme-linked immunosorbent assay and synovial immunohistochemistry experiment. In each experiment， six groups of control experiments（normal group， model group， colchicine positive drug group and GT low， medium and high dose group） were set，with 20 patients in each group. Samples in synovial tissues were observed. The expressions of interleukin-6（IL-6）， tumor necrosis factor-α（TNF-α） and Nod-like receptor protein 3（NLRP3） were detected. The average integral absorbance （IA） was measured. Results It was found that the expression levels of NLRP3 in the GT middle and high dose groups were decreased after treatment， compared with those before treatment（P<0.05）. The expressions of 1β， IL-6， TNF-α and NF-κB were significantly decreased in the GT groups（P<0.05）. Conclusion The use of GT and colchicine in the treatment of acute gouty arthritis may reduce the expressions of inflammatory cytokines in the NLRP3 signaling pathway， and will have a certain impact on the activation of NF-κB and differentiation and maturation of IL-1β in patients.

[Key words] NLRP3； Acute gouty arthritis； Guizhi Shaoyao Zhimu decoction； Anti-inflammatory immunity

痛風是由單尿酸鹽（monosodiumurate，MSU）大量沉積導致的一種晶體相關性關節(jié)病[1-3]。而NLRP3是 NLRP 蛋白家族中的一個典型代表，主要作用為參與識別PAMP、感知內源性DAMPs、在固有免疫系統(tǒng)識別病原體中發(fā)揮著重要的作用。研究NLRP3炎性體信號通路在急性痛風性關節(jié)炎患者治療過程中的變化對治療痛風性關節(jié)炎可能帶來新的突破，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇在我院就診的急性痛風性關節(jié)炎患者360例。主要藥物及試劑：桂枝芍藥知母湯煎劑，其藥物組成為生姜、白術各15 g，知母、防風、附子、桂枝各12 g，白芍9 g、甘草、麻黃各6 g。利用傳統(tǒng)方法和現(xiàn)代科學技術相結合的方法制成質量濃度為（1.25～1.30）g/mL（80℃）的中藥制劑浸膏80 mL，制劑所含生藥量大約為2 g/mL，使用時需適量稀釋。秋水仙堿，質量濃度為20 g/mL的尿酸鈉注射懸液。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 把360例患者隨機分配到3個實驗中，每一個實驗120例患者，實驗分別為蛋白質免疫印跡（western blot）實驗、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）實驗和關節(jié)滑膜免疫組化實驗。每一個實驗分為6組對照實驗，分別為正常組、模型組、秋水仙堿陽性藥組、桂枝芍藥知母湯煎劑（GT）高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組20例。按照規(guī)定給藥，正常組和模型組連續(xù)7 d，每天讓患者在同樣的條件下休養(yǎng)。桂枝芍藥知母湯煎劑（GT）低劑量組用量為4 g/kg，中劑量組用量為8 g/kg，高劑量組用量為12 g/kg，秋水仙堿使用劑量為3×10-3 g/kg。

1.2.2 患者關節(jié)滑膜組織中ASC表達 采集患者少量的關節(jié)滑膜組織，分組封裝后移入低溫冰箱中保存，冰箱溫度設置為-70℃，用于測定各組樣本的IAO含量。使用Quantity One 4. 62版凝膠IA分析軟件分析Western blot檢測中制作好的顯色條帶，測定各組樣本的IAO含量。

1.2.3 患者關節(jié)滑膜組織中NLRP3平均積分吸光度IA的表達 對患者左側關節(jié)（關節(jié)近端及遠端各保留約0. 5 cm）進行采樣。然后依照脫鈣、脫水、切片、染色、封片等步驟進行制片。觀察切片，使用圖像分析軟件對每個切片選取的6個高倍視野（10×40）進行分析，測定IA含量并計算平均IA值[6，7]。

1.2.4 關節(jié)滑膜組織TNF-α、NF-κB、IL-1β、IL-6的表達 對采集到的左側關節(jié)樣本中加入適量液氮，使用研缽將樣本研磨成粉末狀，加入少量生理鹽水研勻，使用離心機以3 000 r/min的速度離心10 min，取上清液測定TNF-α、NF-κB、IL-1β、IL-6的含量并繪制標準曲線，測定[8，9]。

1.3統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0系統(tǒng)進行處理，計量資料以（x±s）形式表示，組間對比使用LDS單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義[10]。

2 結果

2.1 患者體內炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB含量比較

未進行治療前患者均出現(xiàn)關節(jié)紅腫、活動減少的癥狀?；颊唧w內炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB等檢測結果明顯高于正常組（P<0.05）。治療后，GT低、中、高劑量組的IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB表達均下降（P<0.05）。見表1。

2.2 各組NLRP3平均值比較

模型組患者關節(jié)滑膜組織中NLRP3平均IA表達水平比正常組明顯升高（P<0.05）；模型組患者關節(jié)滑膜組織中NLRP3平均IA表達水平比秋水仙堿組和GT高劑量組、中劑量組患者升高（P<0.05）；GT低劑量組患者關節(jié)滑膜組織中NLRP3平均IA表達水平降低，但差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

3討論

近年來，人們生活方式不斷改變，環(huán)境破壞日益嚴重，急性痛風性關節(jié)炎的發(fā)病率出現(xiàn)明顯上升的趨勢，急性痛風性關節(jié)炎對患者的生活質量產生巨大的不利影響[11]。痛風的主要特點為反復發(fā)作，發(fā)作期間中一般會造成關節(jié)損傷，引起關節(jié)疼痛。減輕患者痛苦和不便、防止關節(jié)受損、減少治療痛風的高昂費用、增加生活舒適度等具有非常重要的意義。急性痛風性關節(jié)炎的患者多為青壯年男性，其一般特點是劇烈疼痛和具有自限性。NLRP3是NLRP蛋白家族中的一個典型代表，也被稱為NALP3，會在骨髓源性的免疫細胞中如單核細胞、巨噬細胞等中大量表達，一般是由ASC激活后開始發(fā)揮作用，也就是說使NLRP3炎性體發(fā)揮作用的關鍵點是ACS。

ACS的主要作用有參與識別PAMP，感知內源性DAMPs，在固有免疫系統(tǒng)識別病原體中發(fā)揮著重要的作用，但是NLRP3也具有雙重性，在病毒入侵初期NLRP3的表現(xiàn)會大量增加，這是一種自我免疫保護反應。另一方面，當炎性體感知到外界病毒病菌等的刺激后可能會主動誘發(fā)炎癥反應，導致感染和其他病情加重。雖然NLRP3的這一現(xiàn)象在痛風類相關疾病研究領域中尚無定論，但是不可以排除NLRP3在痛風類相關疾病中存在免疫保護的可能。

目前，NLRP3炎性體在急性痛風性關節(jié)炎和各類感染性疾病中都起到關鍵的作用，研究NLRP3炎性體通路的阻滯可能會為各種慢性炎癥以及急性痛風性關節(jié)炎防治提供新的重要治療方法以及啟迪新的診療思路與手段。當患者患上急性痛風性關節(jié)炎時，患者NLRP3炎性體會在外周血中發(fā)生異常表達，NLRP3對觀察痛風炎癥反應出現(xiàn)起到不可忽視的作用，也證明了NLRP3炎性體在急性痛風性關節(jié)炎中發(fā)揮重要作用。急性痛風性關節(jié)炎與我們的生活習慣密不可分，平時我們要注意飲食與生活習慣，節(jié)制飲酒、適量飲食、少吃高嘌呤的食物，例如豆制品類、高蛋白飲食，注意鍛煉，養(yǎng)成良好的生活習慣對預防急性痛風性關節(jié)炎有一定作用?；颊咦⒁庖陨蠋c再加上積極配合治療，痊愈時間也會縮短。對于NLRP3，充分了解NLRP3炎性體信號通路在急性痛風性關節(jié)炎患者中變化情況以及免疫保護及致炎雙重性并且考慮其對機體的整體影響的條件下做出干預，改良NLRP3，加強NLRP3的免疫保護作用并且減輕副作用可以讓NLRP3的應用更安全，范圍更廣泛，更加值得我們重視和推廣；對于急性痛風性關節(jié)炎而言又有了新的更安全有效的治療和防御手段，可以減少患者痛苦，提高幸福指數(shù)。

綜上，使用GT和秋水仙堿治療急性痛風性關節(jié)炎時可能會降低NLRP3炎性體信號通路中炎性因子的表達，對患者體內的NF-κB的活化和IL-1β 分化成熟也會有一定的影響。

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（收稿日期：2017-04-25）