國藥沉香結香真菌的分離鑒定及分析

馬華明 ，梁坤南 ，周再知 ，楊 偉

國藥沉香結香真菌的分離鑒定及分析

馬華明 ，梁坤南 ，周再知 ，楊 偉

(中國林業(yè)科學研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州510520)

對采自廣東省電白縣的土沉香分創(chuàng)傷組和結香組進行真菌分離培養(yǎng)，通過rDNA中內轉錄間隔區(qū)(ITS)序列鑒定其為10個種。從創(chuàng)傷組來看，創(chuàng)傷短期之內，其真菌種類出現(xiàn)了增多的現(xiàn)象，這一階段是始結香的前期，大量的致病菌的侵染可能導致結香的發(fā)生，創(chuàng)傷結香過程與致病菌有著必然聯(lián)系。從結香組來看，未結香、始結香和已結香部分的真菌種類則依次減少，始結香部分和已結香部分的的真菌多數(shù)相同，包括多變根毛霉Rhizomucor variabilis、再育鐮刀菌Fusarium proliferatum和哈茨木霉Hypocrea lixii，這些真菌能促進沉香的形成。

土沉香；真菌；分子鑒定；ITS 區(qū)

土沉香Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg.又名白木香、莞香、女兒香，是瑞香科Thymelaeaceae沉香屬Aquilaria木本植物，為國家二級瀕危保護植物。土沉香是我國生產名貴中藥材沉香的唯一來源，在我國藥用歷史悠久。此外，在日本、印度以及東盟國家，沉香也是傳統(tǒng)名貴藥材和天然香料。我國中醫(yī)認為，其味辛、苦，性微溫，能行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘[1]。瑞香科Thymelaeaceae沉香屬Aquilaria spp.的部分種和擬沉香屬Gyrinops spp.的部分種，經人為或自然方式使其樹干木材組織在脅迫條件下發(fā)生生物化學過程，酯類物質逐漸增多并積累于木材中，形成了沉香，這一過程又被稱為結香。能生產沉香的植物統(tǒng)稱沉香木，印度、中國、東南亞是沉香的主產國，栽培最為廣泛的沉香木有馬來沉香A. malaccensis、奇楠沉香A. crassna和我國的土沉香A. sinensis。

由于沉香形成過程極其復雜，國內外的學者都做了很多研究。國外早期的研究認為，沉香的形成可能是樹干受到傷害后被真菌侵染，真菌的代謝產物使木材薄壁細胞的淀粉粒發(fā)生生物化學變化，形成脂類，經多年沉積而形成沉香[2-3]，從沉香屬植物樹體的結香部位分離到的真菌種類很多，包括磚紅鐮孢Fusarium laseritum、青霉Penicillium spp. 、曲霉Aspergillus spp. 、毛霉Mucor spp. 、色二孢菌Diplodia spp.、可球二孢菌Botryodiplodia theobromae、木霉Trichodermaspp.、 裂褶菌Schizophyllum spp. 、鐮刀菌Fusarium spp.等[3-8]。在國內，也有學者分離出黃綠墨耳菌Menanotus flavolives[9]，并認為它與沉香形成有關，做了大量的實驗[10-12]支持其觀點，但張爭等[13]對這一研究成果提出了質疑。近年來，王磊等[14]對土沉香內生真菌作了較為全面的研究，分離出了50個菌株，但未將研究重點放在結香這一層面上。為了探索真菌在結香過程中的變化情況，筆者精心設置了人工創(chuàng)傷試驗，并從結香的角度分析了創(chuàng)傷前后的真菌情況；還根據不同結香程度，對結香過程中的真菌類別作了闡述，本研究內容在國內尚屬首次，旨在揭示結香過程與真菌之間的關聯(lián)，為將來開展結香真菌篩選與接菌結香技術的研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

在廣東省電白縣采集試驗樣品，土沉香由中國林科院熱帶林業(yè)研究所森林培育實驗室鑒定，分離真菌所用的樣品材料分為兩組：A組為創(chuàng)傷組，即在選取胸徑30 cm以上的3株成年土沉香，在樹干上從離地面40 cm、70 cm和100 cm處鉆一個直徑約10 cm深至髓心的水平孔，孔徑2 cm，鉆后第0天、90天和180天分別取一個孔周（不含表層）木材作為分離真菌的材料，代表不同創(chuàng)傷時間樣品；B組為結香組，選經鑒定已結香的沉香樹3株，根據不同結香程度分別取樣作為分離真菌的材料，即未結香（色澤仍為白木）、已結香（與成品沉香色澤一致）和始結香（位于未結香和已結香之間的過渡帶，色澤較成品沉香淺），代表不同結香程度樣品。樣品自植物體取下后，用無菌水反復沖洗，再用濾紙吸干樣品表面的水分，用密封袋裝好后帶回實驗室。

1.2 分離純化菌株

預先備好用于分離真菌的綜合PDA培養(yǎng)基。取回的樣品需先在0.1% 的HgCl2溶液中浸泡1 min，取出用無菌水沖洗，再用75%乙醇中浸泡1 min和無菌水沖洗，然后在超凈工作臺將樣品放入備好的培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)皿置于26 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱，待形成菌落后，根據菌落特征，挑取單一菌落的菌絲轉接至新的培養(yǎng)皿，繼續(xù)在26 ℃下恒溫培養(yǎng)。經多次分離直到純化，所獲菌株轉接試管保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA制備

從培養(yǎng)皿上挑取少量菌絲體移入已滅菌的1.5 mL微型離心管中，加入30 μL 尿素提取液(1.5% SDS，7 mol/L尿 素，0.05 mol/L Tris-HC1 pH 8.0，0.5 mol/L NaCl)，搗碎材料，然后將材料置于液氮中冷卻，再取出繼續(xù)搗碎至融化，如此反復3次。之后，加入尿素提取液300 μL，在液氮中冷卻后置于65℃迅速融化，反復凍融3～4次后，再加入等量的V(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1，在13 000 r/min下離心10 min。取上清液加入等量(氯仿) ∶V(異戊醇)=24∶1，于13 000 r/min下離心10 min。再取上清液，加入微量RNase A，置于37 ℃恒溫箱中30 min。最后，加入3倍體積無水乙醇，3 mo/L NaAc(pH 5.2)，在-20 ℃放置30 min 以上后，13 000 r/min離心15 min。取沉淀物，分別用70%乙醇和無水乙醇洗滌，風干后加入50 μL TE回溶。取1 μL回溶液在1%的瓊脂糖凝膠上作電泳檢查，其余置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增與測序

通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'， 正 向)和ITS4(5'-TCCTCCGCTrATrGATATGC-3'，反向 )擴增分離菌株的rDNA內轉錄間隔區(qū)(ITS區(qū))，采用Ex Tag(TaKaRa)進行PCR反應。反應條件:首先，93 ℃預變性3 min；然后，93 ℃變性1 min，53 ℃復性1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；最后，72 ℃延伸 10 min。

用PCR產物純化試劑盒(QIAGEN)純化反應產物，純化后則用Tag I及Hha I 2種限制性內切酶(TaKaRa) 進行酶切分型，依分型結果進行測序。

1.5 菌株鑒定

運行blast程序，對測序所獲序列在GenBank上進行相似性檢索，根據blast結果，確定分離菌株的種類。對于無法確定的分離株，將其序列以及近似序列導入MEGA version 3.1[15]中進行比對，采用鄰位互換算法(CNI)搜索最小進化樹(ME tree)，并進行l(wèi) 000次重復的自展檢驗(bootstrap)，ME樹上與之最接近的種類則為分離菌株可能的種類。

2 結果與分析

2.1 創(chuàng)傷與真菌關系

土沉香樹干經創(chuàng)傷后，隨著時間的推移，在傷口無法愈合的情況下，會形成沉香，但這是一個緩慢的過程并受當?shù)丨h(huán)境影響，時間的長短并不確定。在本試驗中，創(chuàng)傷180 d時仍處于未形成沉香的階段。

從表1中可以看出，創(chuàng)傷0天（即未創(chuàng)傷）時，樣品中僅分離出哈茨木霉Hypocrea lixii。哈茨木霉是一種植物益生菌，除了它的代謝產物有助于植物對水分和養(yǎng)分的吸收外，它還是一個菌寄生真菌，被廣泛應用于植物真菌病害防治，它至少可寄生于18個屬中的29種植物病原真菌，哈茨木霉菌主要通過識別寄主后纏繞寄主真菌的菌絲，隨后產生細胞壁降解酶和抗生素以及對空間和營養(yǎng)的競爭機制達到防治植物病原菌的目的[16-17]。正常生長的土沉香素有“百年白木”之說，或許跟存在哈茨木霉有一定的關聯(lián)。創(chuàng)傷90天后，除了哈茨木霉，還出現(xiàn)了一個致病菌—可可毛殼色單隔孢Lasiodiplodia theobromae，而創(chuàng)傷180 d后，還出現(xiàn)了茄病鐮刀菌Fusarium solani、彎孢菌Curvularia spp.和小孢擬盤多孢Pestalotiopsis microspora這3個菌種，這3個菌種均為致病菌。綜上所述，當土沉香受到創(chuàng)傷之后致病菌會隨之增加，可以推斷，創(chuàng)傷結香過程與致病菌有著必然聯(lián)系，而且這一過程是多種致病菌共同作用的結果，由于創(chuàng)傷之后出現(xiàn)的致病菌在未創(chuàng)傷樹干組織并未發(fā)現(xiàn)，推斷這些致病菌是通過創(chuàng)傷傷口從外界進入的。

表1 不同創(chuàng)傷時間的樣品真菌種類Table 1 The fungi species in samples from hurted trunk with different time

2.2 結香程度與真菌關系

結香組樣品中未結香部分從表觀上未有結香跡象（即仍為白色），但從分離的真菌種類來看，該部分的真類種類最多，有5種，均為致病菌（見表2）。通常，在自然狀態(tài)下，木材組織由健康白木向沉香轉變的過程是一個漫長的過程，少則幾年多則幾十年，結香組樣品中未結香部分正處于這一變化過程中，這部分出現(xiàn)了多種真菌，說明，未結香部分朝著結香方向變化需要多種真菌參與才可能發(fā)生。就真菌種類而言，按未結香→始結香→已結香順利依次減少，而且前者與后兩者分離的真菌大多數(shù)不是同種，這說明隨著沉香物質的形成對某些真菌有一定的抑制作用，這些真菌難以生存，取而代之的是其它的真菌，但總的菌種種類會隨之減少。在有沉香物質的部分，即始結香部分和已結香部分，真菌比較接近，都發(fā)現(xiàn)了再育菌刀菌Fusarium proliferatum和多毛孢菌Pestalotiopsis palmarum，均為致病菌，這些致病菌仍能在含沉香特質的木材中生存，仍能促進沉香物質的形成。可見，沉香的形成過程并不是某一些真菌自始至終的結果。

表2 不同結香程度的真菌種類Table 2 The fungi species in no-agar wood, little-agar wood and agar wood of samples

3 討 論

本試驗所分離菌株通過rDNA中內轉錄間隔區(qū)(ITS)序列鑒定，均具有99%以上的相似序列，其中確定至種名的有9種，僅確定至屬名的有1種。

從創(chuàng)傷組來看，創(chuàng)傷短期之內，其真菌種類出現(xiàn)了增多的現(xiàn)象，但本試驗只考察到創(chuàng)傷180天菌種，從結香過程來看，180天仍處于未結香階段，這一階段是始結香的前期，大量的致病菌的侵染才可能倒致結香的發(fā)生，這與結香組的樣品菌類分析結果是一致的，即未結香部分真菌種類較多。

從結香組來看，在有沉香物質的部分，即始結香部分和已結香部分，都發(fā)現(xiàn)了多變根毛霉Rhizomucor variabilis、再育鐮刀菌Fusarium proliferatum和肉座菌Hypocrea lixii，從始結香到已結香，它們并沒有由于沉香物質的增多而消亡，可以認為它們的存在與沉香物質的增多有一定的關聯(lián)性，換言之，它們促進了沉香物質的形成。

綜合創(chuàng)傷組和結香組的真菌種類來看，發(fā)現(xiàn)：(1)創(chuàng)傷之后的樣品和結香組的樣品并不存在相同的真菌，唯一共同之處在于所分離的真菌均為致病菌，可見，沉香結香過程與致病菌有關，可能還是多種致病菌共同作用的結果，該結論與國外的研究一致[2-3]；(2)一旦木材組織受到創(chuàng)傷，侵染的真菌會呈增加的趨勢，但當有沉香物質形成以后，一些真菌會消亡，相應地真菌種類會逐漸減少。

值得一提的是，本文在結香部位所分離出的菌株與國外的研究不盡相同，可能是樣品的地域性所致，即每一樣品的真菌種類與該樣品所處的環(huán)境悉悉相關，但同時也說明不同地區(qū)的沉香形成所需的微生物是不同的，換言之，沉香的形成并不是某一特定真菌作用的結果。本文所揭示的土沉香結香與致病真菌之間的關系，對我國開展人工接菌結香技術生產國藥沉香具有一定的指導意義。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] Tamuli P , Boruah P , Samanta R. Biochemical changes in agarwood tree ( Aquilaria malaccensis Lamk. ) during pathogenesis [J]. Journal of Spices and Aromat Crops, 2004, 13:87-91.

[3] Ng L T , Chang Y S , Azizol L K. A review on agar (gaharu)producing Aquilaria species [J]. Journal of Trop for Products,1997 , 2 (2) : 272-285.

[4] Bose S R. The nature of agar formation [J]. Science Culture,1934，4 (2) ： 89-91.

[5] Bose S R. Enzymes of wood-rotting fungi [J]. Ergeb Enzymforsch , 1939, 8 : 267-276.

[6] Subeham , J unya U , Fujino H , et al. A field survey of agarwood in Indonesia [J]. Journal of Trad. Med., 2005 , 22 (4) : 244-251.

[7] Gibson I A S. The role of fungi in the origin of oleoresin deposit(Agaru) in the wood of Aquillaria agallocha (Roxb1 )[J]. Bano Biggyn Patrika, 1977, 6 (1) : 16-26.

[8] Qi S Y, Lu B Y, Zhu L F , et al. Formation of oxoagarospirol in Aquliaria sinensis [J ]. Plant Phys. Commun., 1992, 28: 336-339.

[9] 曾幻添，董文忠，吳質樸. 沉香的人工結香[J].中草藥通訊，1978,(12):38-40

[10] 戚樹源，林立東，葉勤法. 沉香中節(jié)基丙酮及其在黃綠墨耳真菌中的生物轉化[J].生物工程學報，1998,14(4):464-466

[11] 戚樹源，陸碧瑤，朱亮鋒，等. 白木香中白木香醛形成的研究 [J]. 物生理學通訊, 1992, 28 (5):336-339

[12] 戚樹源，林立東，胡厚才. 白木香中色酮類化合物的形成[J]. 中草藥，2000,31(9):658-659

[13] 張 爭，楊 云，魏建和，等. 白木香結香機制研究進展及其防御反應誘導結香假說[J]. 中草藥，2010,41(1):156-159.

[14] 王 磊，章衛(wèi)民，潘清靈，等. 白木香內生真菌的分離及分子鑒定[J]. 菌物研究，2009, 7(1):37-42.

[15] Kumar S，Tamura K， Nei M． MEGA3:Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment[J]．Briefings in Bioinformatics，2004，5(2):150-163．

[16] 石一珺，申屠旭萍，俞曉平. 重寄生菌哈茨木霉的研究及其在植病生防中的應用[J]. 生物技術通報, 2008,(增刊):76-78.

[17] 汪騰越，周再知，裘珍飛，等.土沉香組織培養(yǎng)外植體消毒方法的研究[J].中南林業(yè)科技大學學報, 2012, 32(3):44-48.

Isolation, identification and analysis of fungi of agarwood formation

MA Hua-ming, LIANG Kun-nan, ZHOU Zai-zhi, LIN Ming-ping, , YANG Wei
(Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangzhou, China)

The fungi were isolated from two groups of samples of Aquilaria sinensis at Dianbai, Guangdong province, including the trauma group and agarwood group. Ten fungi species were identified by DNA sequence of ITS regions. It was found that the pathogenic fungi species increased quickly in the short time after the trunk hurted. It was shown that the pathogenic fungi were correlative with agar formation, in another word, the pathogenic fungal infection would induce agar formation after the trunk hurted. Moreover, the fungi species were analyzed based on agarwood group, which was divided into three parts including no-agar wood, little-agar wood and agar wood, it was found that the pathogenic fungi species number was the maximum in the no-agar wood part, and the pathogenic fungi species numbers were fewer in the little-agar wood and agar wood. Most of fungi in the little-agar wood part and agar wood part were the same. The fungi and Rhizomucor variabilis, Fusarium proliferatum, and Hypocrea lixii played an important role in agar formation.

Aquilaria sinensis；endophytic fungi；molecular identification；rDNA ITS

S759；Q949.761.1

A

1673-923X (2012)07-0072-04

2012-04-01

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項“熱帶珍貴樹種良種選育和高效培育技術研究”（201204301-1）;國家中央級科研究院所基金項目“土沉香結香真菌篩選與結香技術研究”（RITF2010-08）

馬華明(1977—)，男，福建連城人，助理研究員，從事沉香產香技術的科研工作；E-mail：fjmhm@163.com

[本文編校：吳 毅]