寬苞十大功勞提取物抑菌活性的初步研究

歐陽(yáng)蒲月，朱翠霞，陳功錫，莫端峰

寬苞十大功勞提取物抑菌活性的初步研究

歐陽(yáng)蒲月1,2，朱翠霞1，陳功錫2，莫端峰2

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510520； 2.吉首大學(xué) 植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南吉首416000）

對(duì)民間藥用植物寬苞十大功勞Mahonia eurybracteata Fedde提取物的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明：(1)通過(guò)對(duì)不同部位提取物所進(jìn)行的抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)葉和莖均含有有抑菌活性物質(zhì)，但莖的抑菌效果更強(qiáng)更明顯。(2)對(duì)超聲提取和索氏提取二個(gè)方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)索氏提取物抑菌效果與超聲提取抑菌效果只存在較小的差異。(3)寬苞十大功勞提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、藤黃球菌、黑曲霉、白色念珠菌的最低抑菌濃度分別為0.6 g/mL、2.0 g/mL、1.0 g/mL、0.8 g/mL、2.0 g/mL、0.6 g/mL；但黑曲霉最小殺菌濃度為4 g/mL外，其它菌的最小殺菌濃度均為2 g/mL。(4)不同溶劑提取物中，65%乙醇溶液提取物具有最佳抑菌效果。不同極性溶劑的抑菌試驗(yàn)表明，抑菌活性物質(zhì)易溶于石油醚、乙醚等非極性溶劑。這些結(jié)果為開(kāi)發(fā)新型、安全、高效的臨床藥物提供依據(jù)，也為擴(kuò)大藥源提供科學(xué)依據(jù)。

寬苞十大功勞；提取物；抑菌活性；不同溶劑；索氏提取；超聲提取

中國(guó)藥典注明功勞木為小檗科植物闊葉十大功勞和細(xì)葉十大功勞(狹葉十大功勞)的莖入藥，其有清熱燥濕、瀉火解毒之功效。現(xiàn)代研究證明具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛等多種生理活性。其有效成分為小檗堿、藥根堿等多種生物堿，但各種成分的比例隨植物種不同而異，因而功效也不盡相同[1]。

寬苞十大功勞Mahonia eurybracteata Fedde屬于小檗科Berberidaceae十大功勞屬M(fèi)ahonia，產(chǎn)于貴州、四川、湖北、湖南、廣西。生于常綠闊葉林中、竹林中、灌叢中、林緣、草坡或向陽(yáng)巖坡。海拔350～1 950 m。為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載品種。以根入藥，具有清肺熱、瀉火的功效[2]。有研究表明寬苞十大功勞含有小檗堿、巴馬亭、藥根堿、 黃連堿、尖刺堿、非洲防己堿、巴蘆奇堿等物質(zhì)[3-6]。十大功勞屬植物的化學(xué)成分主要是生物堿類[7]，具有抗菌、消炎、抗病毒、抗癌[8-10]、抗心率失常、降血糖、抗血小板聚集、松弛平滑肌等作用，而且冬青葉十大功勞的莖的提取物治療牛皮癬療效確切，受到國(guó)內(nèi)外廣泛的關(guān)注。

寬苞十大功勞資源豐富,目前尚僅有對(duì)其所含有的生物堿及非生物堿類等化學(xué)成分方面進(jìn)行了研究同[11-12]。本文對(duì)寬苞十大功勞的抑菌活性進(jìn)行初步研究，為寬苞十大功勞的傳統(tǒng)藥用價(jià)值以及后續(xù)研究建立科學(xué)根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材 料

于湘西自治州吉首市又一村鮮采寬苞十大功勞地上部分，由吉首大學(xué)陳功錫教授鑒定為寬苞十大功勞Mahonia eurybracteata Fedde。將其室溫陰干，將葉與莖分離，65 ℃烘干，分別粉碎過(guò)100目篩。

試驗(yàn)用菌均購(gòu)自湖南省疾病預(yù)防控制中心，分別為：金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大腸桿菌Escheichia coli、枯草桿菌Bacillus subtilis、藤黃球菌Micrococcus luteus、黑曲霉Aspergillus niger、白色念珠菌Monilia albicans。細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)24 h以試管斜面培養(yǎng)基保存，真菌在29 ℃培養(yǎng)72 h，轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)皿中，分別存以備用。

1.1.2 主要儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE540 Yamato)、pH計(jì)(HM-205TOA)、冷凍干燥機(jī)(FD-1)、培養(yǎng)箱(PW/10-002)、超凈工作臺(tái)(CCV-1311)、高壓蒸汽滅菌器(SM-52)、分析天平(AEG-220)、索氏提取器。

1.1.3 主要試劑

95%乙醇、無(wú)水甲醇、石油醚、乙醚、濃鹽酸、硼酸、氨水、NaOH、瓊脂、牛肉膏、蛋白胨，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。市售黃連素（四川亞寶光泰藥業(yè)有限公司）。

1.2 方 法

1.2.1 抑菌活性物質(zhì)的提取與分離

1.2.1.1 不同部位提取物：取不同部位材料5 g，加入65%乙醇溶液100 mL，先超聲提取30 min，然后45 ℃水浴30 min，趁熱過(guò)濾，濃縮至5 mL，使生藥濃度為1 g/mL。

1.2.1.2 不同溶劑提取物：取試驗(yàn)1.2.1.1中抑菌效果最強(qiáng)部位材料5 g，分別用蒸餾水、甲醇、65%乙醇、95%乙醇作溶劑，按上述方法提取。

1.2.1.3 不同提取方法：超聲提取如1.2.1.1。索氏提取方法如下：取試驗(yàn)1.2.1.1中抑菌效果最強(qiáng)部位材料5 g，裝入索氏提取器的濾紙?zhí)淄仓?，加?00 mL95%乙醇萃取液，加沸石數(shù)粒，于80℃水浴加熱，水浴回流提取4 h，提取完畢，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近5 mL，定容至5 mL。

1.2.1.4 不同溶劑萃取物：稱取試驗(yàn)1.2.1.1中抑菌活性最強(qiáng)的部位50 g，加入試驗(yàn)1.2.1(2)最佳提取溶液500 mL，按上述方法提取，重復(fù)1次，合并濾液，濃縮至50 mL，使生藥濃度為1 g/mL。濾液依次用石油醚、乙醚進(jìn)行萃取（每次加有機(jī)溶劑50 mL，混勻，靜置30 min，取上層液，下層液再用以上萃取液重復(fù)萃取兩次，合并萃取液），得到石油醚萃取物A、乙醚萃取物B，濃縮萃取物，回收溶劑，萃取物以甲醇定容至50 mL，使生藥濃度為1 g/mL。

1.2.2 抑菌（細(xì)菌）活性測(cè)定

1.2.2.1 含藥濾紙片準(zhǔn)備：用打孔器將定性濾紙打成直徑為5 mm的小圓片，置培養(yǎng)皿內(nèi)高壓滅菌后，分別浸泡在不同供試藥液中，備用。陰性對(duì)照浸泡無(wú)菌水，陽(yáng)性對(duì)照浸泡黃連素溶液。

1.2.2.2 接種： 用竹簽挑取細(xì)菌放入無(wú)菌水成稀釋菌液，用移液器吸取120 μL稀釋菌液滴在直徑為9 cm的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿中央，用玻璃刮鏟將菌液均勻地涂布于整個(gè)平板上，于培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)10～15 min至培養(yǎng)基表面干燥后， 分別將含藥濾紙片均勻地放置在接種了不同受試菌的培養(yǎng)基表面，每皿放4片含藥濾紙片，稍加按壓使之緊貼培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，取出平板，測(cè)量各紙片周圍抑菌圈直徑。

1.2.3 含毒介質(zhì)法抑菌(真菌) 活性測(cè)定

1.2.3.1 含毒培養(yǎng)基的制備：在無(wú)菌條件下，取提取液5 mL，10 mL 2個(gè)梯度加入25 mL50 ℃左右的培養(yǎng)基中，得到相應(yīng)的含提取液的培養(yǎng)基，充分振蕩混勻后倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，每濃度為2個(gè)重復(fù)，每菌株抑菌試驗(yàn)重復(fù)2次，對(duì)照培養(yǎng)基為空白培養(yǎng)基，即不加任何提取液，只加相應(yīng)體積的無(wú)菌水。

1.2.3.2 接種培養(yǎng)：取培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5～7 d（菌絲均勻布滿培養(yǎng)基表面）的供試菌種，用直徑為5 mm的無(wú)菌玻璃管在菌落邊緣切取帶菌培養(yǎng)基（菌餅），用接種針將菌餅分別接種至冷卻后的含毒培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，每個(gè)平皿接種菌餅1塊，置28 ℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3至4 d，待對(duì)照組培養(yǎng)皿中的菌絲體充分生長(zhǎng)后（孢子不成熟），測(cè)量處理組和對(duì)照組菌落直徑，計(jì)算各處理濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)速率的抑制百分率。

1.2.3.3 抑菌作用計(jì)算方法：按十字交叉法測(cè)量菌落直徑2次，取其平均值為菌落的大小，提取液的抑菌百分率按下式計(jì)算：抑制率(%)＝（對(duì)照組菌落的平均直徑－處理組菌落的平均直徑）/對(duì)照組菌落的平均直徑×100%。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)測(cè)定

取試驗(yàn)1.2.1中抑菌效果最佳萃取物稀釋成含生藥濃度 4.0、2.0、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05 g/mL的試液，取藥液0.1 mL加入到盛有0.8 mL的液體培養(yǎng)基中，接入0.1 mL的菌懸液，搖勻，置37 ℃搖床(200 r/min)培養(yǎng)24 h。若液體培養(yǎng)基完全清亮，表示無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最小濃度為最小抑菌濃度。另設(shè)未加菌液為空白對(duì)照、黃連素作陽(yáng)性對(duì)照。

將無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基中取出0.1 mL涂布平板，置37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最小濃度為最小殺菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位的抑菌活性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1、表2、表3）表明，寬苞十大功勞的葉與莖對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、藤黃球菌、白色念珠菌均有一定的抑制作用，對(duì)大腸桿菌、黑曲霉的抑制作用均較弱，但莖提取物較葉提取物抑菌效果強(qiáng)。

表1 寬苞十大功勞不同部位提取物對(duì)抑菌活性的影響比較(65%乙醇)?Table 1 Comparision of antibacterial activity to the extracts from different part of Mahonia eurybracteata (65%alcohol)

表2 寬苞十大功勞不同部位提取物對(duì)抑菌活性的影響比較(95%乙醇)Table 2 Comparision of antibacterial activity to the extracts from different part of Mahonia eurybracteata (95%alcohol)

表3 寬苞十大功勞不同器官部位提取物對(duì)抑菌活性的影響比較(真菌)?Table 3 Comparision of antibacterial activity to the extracts from different part of Mahonia eurybracteata Fedde (fungus)

2.2 不同溶劑提取物的抑菌活性

不同溶劑提取寬苞十大功勞的莖粉末所得到的提取物抑菌試驗(yàn)（表4、5）表明，65%乙醇的提取物對(duì)各菌的抑制效果最強(qiáng)；無(wú)水甲醇的提物次之；95%乙醇的提物再次之；蒸餾水的最弱。由此推測(cè)，寬苞十大功勞的抑菌活性物質(zhì)可能具有表面活性，醇濃度太高或者用蒸餾水(不含有醇類基團(tuán))都不利于其溶解釋出。

表4 不同溶劑提取寬苞十大功勞的提取物對(duì)抑菌活性的影響比較（細(xì)菌）Table 4 Comparision of antibacterial activity to the extracts from Mahonia eurybracteata in different solvent (viruses)

表5 不同溶劑提取寬苞十大功勞的提取物對(duì)抑菌活性的影響比較（真菌）Table 5 Comparision of antibacterial activity to the extracts from Mahonia eurybracteata in different solvent (fungus)

2.3 不同提取方法對(duì)寬苞十大功勞抑菌活性的影響

從結(jié)果（表6、表7）發(fā)現(xiàn)，索氏提取與超聲提取所得到的提取抑菌效果只存在很小的差異。

表6 不同提取方法對(duì)提取寬苞十大功勞抑菌活性的影響比較Table 6 Effect of acid and alkali on the antibacterial activity to the extracts from Mahonia eurybracteata e(viruses)

表7 不同提取方法對(duì)提取寬苞十大功勞抑菌活性的影響比較（真菌）Table 7 Effect of acid and alkali on the antibacterial activity to the extracts from Mahonia eurybracteata (fungus)

2.4 不同溶劑萃取物的抑菌活性

除對(duì)大腸桿菌抑菌效果較弱外，乙醚萃取物對(duì)5種菌的抑制效果均好，遠(yuǎn)大于陽(yáng)性對(duì)照黃連素；石油醚萃取物對(duì)5種菌也有一定抑制效果；萃余物對(duì)各菌均無(wú)抑制效果（表8、表9）。表明寬苞十大功勞的抑菌活性物質(zhì)易溶于非極性溶劑。乙醚對(duì)減弱抑菌活性的貢獻(xiàn)最大，石油醚次之，這兩種溶劑能夠?qū)⒁志钚晕镔|(zhì)萃取完全，因此成分提取時(shí)應(yīng)選用這類非極性溶劑。

表8 不同極性溶劑萃取寬苞十大功勞的提取物抑菌活性的比較(細(xì)菌)Table 8 Comparision of antibacterial activity to the extracts from Mahonia eurybracteata extracted in different nonpolar solvent(viruses)

2.5 最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC)

寬苞十大功勞提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、藤黃球菌、黑曲霉、白色念珠菌的最低抑菌濃度分別為0.6 g/mL、2.0 g/mL、1.0 g/mL、0.8 g/mL、2.0 g/mL、0.6 g/mL；但黑曲霉最小殺菌濃度為4.0 g/mL外，其它菌的最小殺菌濃度均為2.0 g/mL（表10、表11）。

表9 不同極性溶劑萃取寬苞十大功勞的提取物抑菌活性的比較（真菌）Table 9 Comparision of antibacterial activity to the extracts from Mahonia eurybracteata extracted in different nonpolar solvent (fungus)

表10 最小抑菌濃度測(cè)定?Table 10 MIC test of ethereal extract

表11 最小殺菌濃度測(cè)定?Table 11 MBC test of ethereal extract

3 討 論

本研究對(duì)寬苞十大功勞的葉和莖等不同部位的65%乙醇、95%乙醇提取物進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，篩選更有效抑菌部位，并進(jìn)一步用不同溶劑對(duì)有效抑菌部分進(jìn)行抑菌成分的提取和萃取，用不同提取方法得到的提取物對(duì)比抑菌效果的不同，最后再用不同的溶劑萃取提取物對(duì)比抑菌效果的不同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）寬苞十大功勞的抑菌活性物質(zhì)存在于葉和莖中，但莖提取物的抑菌活性更強(qiáng)；這也很好的解釋了為什么在民間，其以莖木入藥為主且其藥材稱為功勞木。（2）華南十大功勞的65%乙醇溶液提取物具有最高的抑菌活性，說(shuō)明華南十大功勞的化學(xué)成分中含有極性物質(zhì)，但它的抑菌活性物質(zhì)可能具有表面活性，醇濃度太高或者用蒸餾水(不含有醇類基團(tuán))都不利于其溶解釋出。對(duì)5種所試菌株的敏感性由強(qiáng)到弱依次為：金葡菌>藤黃球菌>枯草桿菌>大腸桿菌>白色念珠菌>黑曲霉。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對(duì)同屬植物闊葉十大功勞的抑菌作用[13]、小檗堿抑菌[14]、巴馬汀抑菌[15]相似。還有研究發(fā)現(xiàn)冬青葉十大功勞中分離得到的小檗堿對(duì)大腸桿菌、草桿菌、金黃色葡萄球菌等17種細(xì)菌也具有抑制作用[16]，且相關(guān)菌的敏感性由強(qiáng)到弱位次是；金葡菌>大腸桿菌>枯草桿菌>白色念珠菌>黑曲霉。這與我們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也是相似的。（3）對(duì)超聲提取和索氏提取二個(gè)方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)索氏提取物抑菌效果與超聲提取抑物菌效果只存在較小的差異。說(shuō)明抑菌活性物質(zhì)的提取與提取時(shí)間及與溶劑相互接觸時(shí)間的影響不是很大。但索氏提取物對(duì)黑曲霉不抑菌，說(shuō)明索氏提取環(huán)境不利于提取抑制黑曲霉的化學(xué)成分。（4）提取物中的抑菌活性成分易溶于乙醚等非極性溶劑中，說(shuō)明其化學(xué)成分除了有極性成分外，還有我們不知道的非極性成分。因此還需要下一步對(duì)其進(jìn)行化學(xué)成分的分離與鑒定，為臨床用藥開(kāi)發(fā)新型、安全、高效的藥物提供依據(jù)，也為擴(kuò)大藥源提供科學(xué)依據(jù)。

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Preliminary research of antimicrobial activity of extract from Mahonia eurybracteata Fedde

OUYANG Pu-yue1,2, ZHU Cui-xia1, CHEN Gong-xi2, MO Duan-feng2
(1.Guangdong Food and Grug Vocational College, Guangzhou 510520, Guangdong, China;2.Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Utilization, Jishou University, Jishou 416000, Hunan, China)

The bacteriostatic test of extract from Mahonia eurybracteata Fedde, one of medical plants was carried out, the results are as followings.(1) The antibacterial substance existed in the stems and leaves, and leaves’s extract was more sensitive.(2) Comparing the bacteriostatic test from the extracting methods of Ultrasonic and Soxhlet, it was found that there was little difference on the two different methods.(3) The minimal inhibitory concentration of the extract on Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis，Micrococcus luteus，Aspergillus niger，Monilia albicans were 0.6, 2.0, 1.0, 0.8, 2.0, 0.6, 1.0 g/mL respectively; the minimal bactericidal concentration all were 2 g/mL expect Aspergillus niger was 4 g/mL.(4) In order to get the extract that has the optimum antibacterial effect, the solvent should be 65% alcohol.The bacteriostatic test by different polar solvent shows that the antibacterial substancy easily dissolved in non-polar solvent such as petroleum ether, ethyl ether.The bacteriostatic test of extract from Mahonia eurybracteata Fedde provides the basis for new and safety and high efficiency clinical application.

Mahonia eurybracteata Fedde; extract; antimicrobial activity; different solvent; Soxhlet extraction ; ultrasonic extraction

S789.9

A

1673-923X(2012)03-0166-05

2011-10-19

植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放項(xiàng)目(JZ200906)；南藥資源保護(hù)與利用工程技術(shù)開(kāi)發(fā)中心建設(shè)項(xiàng)目（GCZX-B0905）

歐陽(yáng)蒲月(1978—)，女，湖南邵陽(yáng)人，講師，碩士，從事藥用植物學(xué)的教學(xué)與研究工作；E-mail：ouyangpy@gdyzy.edu.cn

陳功錫(1966—)，男，湖南桑植人，教授，電話：15874639263；E-mail： chengx@jsu.edu.cn

[本文編校：吳 毅]