CT引導(dǎo)下髓核鉗取技術(shù)制備犬椎間盤(pán)退變模型的實(shí)驗(yàn)研究

石志遠(yuǎn)，顧 韜，張 超，王德利，阮狄克

CT引導(dǎo)下髓核鉗取技術(shù)制備犬椎間盤(pán)退變模型的實(shí)驗(yàn)研究

石志遠(yuǎn)，顧 韜，張 超，王德利，阮狄克

目的 探索CT引導(dǎo)下使用活檢槍髓核鉗取技術(shù)構(gòu)建犬椎間盤(pán)退變模型可行性，比較不同型號(hào)活檢槍制備犬椎間盤(pán)退變模型效力。方法 選取6只1歲齡雌性雜種犬。將犬腰1-2、腰3-4及腰5-6椎間盤(pán)納入退變模型制備實(shí)驗(yàn)研究，并行隨機(jī)分組。A組使用18號(hào)活檢槍;B組使用20號(hào)活檢槍;C組使用24號(hào)活檢槍。行經(jīng)皮椎間盤(pán)穿刺。術(shù)后4周及12周分別行核磁及數(shù)字平片檢查，評(píng)估各組椎間盤(pán)高度變化及髓核含水量狀態(tài);術(shù)后12周處死動(dòng)物，行組織學(xué)分析。結(jié)果 每組取出髓核組織量A組(3.0±0.53)mg、B組(2.01±0.34)mg和C組(3.0±0.53)mg。平均操作時(shí)間為1.4 h;出血量為5～10 ml。術(shù)前椎間盤(pán)高度數(shù)測(cè)量做為基線，3組間高度比較無(wú)明顯差別(P＞0.05)。術(shù)后3組椎間盤(pán)高度均有不同程度降低，但組內(nèi)差異及同一時(shí)間點(diǎn)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。3組中，MRI相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度均出現(xiàn)下降，與術(shù)前對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P＞0.05)。術(shù)后第12周，A組MRI相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)明顯下降，與B組和C組相比下降程度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與術(shù)前相比，術(shù)后第12周A組和B組降低程度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 CT引導(dǎo)下活檢槍髓核鉗取技術(shù)可用于犬椎間盤(pán)退變模型制備;20號(hào)活檢槍制備的退變模型在12周觀察期內(nèi)顯示出較為緩和、重復(fù)性高、可信性強(qiáng)的退變進(jìn)程，適用于椎間盤(pán)退變生物治療研究。

椎間盤(pán)退變;相對(duì)灰度指數(shù);動(dòng)物模型

椎間盤(pán)退行性疾病在世界各國(guó)發(fā)病率均較高，加重各國(guó)醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，減少社會(huì)平均勞動(dòng)時(shí)間并降低患者生活質(zhì)量。盡管已有多種治療策略應(yīng)用于該疾病及相關(guān)疾病的治療，但其療效仍然有限［1-2］。隨著新的治療策略的不斷開(kāi)發(fā)，適合于檢驗(yàn)新治療方法療效的椎間盤(pán)退行性疾病動(dòng)物模型的開(kāi)發(fā)也勢(shì)在必行。目前，纖維環(huán)損傷誘導(dǎo)椎間盤(pán)退變的動(dòng)物模型被廣大的研究機(jī)構(gòu)及學(xué)者所接受［3-5］。然而，模型制備方式多選擇開(kāi)放手術(shù)直視下?lián)p傷纖維環(huán)結(jié)構(gòu)引發(fā)椎間盤(pán)退變，這種方式不僅增加了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡風(fēng)險(xiǎn)、延長(zhǎng)術(shù)后康復(fù)時(shí)間，而且存在椎間盤(pán)髓核急性突出及嚴(yán)重退變的可能。CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺活檢術(shù)作為一種安全、可靠、成熟的臨床應(yīng)用技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床病理診斷［6］。因此我們?cè)O(shè)想采用該技術(shù)，通過(guò)CT三維定位，經(jīng)皮穿刺進(jìn)入髓核組織，鉗取一定量的髓核組織，以此來(lái)誘導(dǎo)椎間盤(pán)退變進(jìn)程的發(fā)生，從而探索髓核鉗取技術(shù)制備椎間盤(pán)退變動(dòng)物模型的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雜種犬6只(海軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，電子計(jì)算機(jī)X射線斷層掃描機(jī)(Philips，美國(guó))，鹽酸氯胺酮注射液(江蘇恒瑞，中國(guó))，咪達(dá)唑侖注射液(宜昌人福，中國(guó))，活檢槍(Quickcore，美國(guó))，電子天平(上海天平儀器，中國(guó))，數(shù)字X線成像儀(Siemens，德國(guó))，核磁共振掃描儀(Signa Horizon，美國(guó))，福爾馬林(4%甲醛配置)，EDTA脫鈣液(舜百，中國(guó))，倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 動(dòng)物選取 6只1歲齡雌性雜種犬，體質(zhì)量10～12 kg，由海軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，并在制備椎間盤(pán)退變模型前隔離檢疫10 d。實(shí)驗(yàn)前行核磁及數(shù)字平片檢測(cè)，剔除脊柱結(jié)構(gòu)異常及已發(fā)生的椎間盤(pán)退變的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)倫理委員會(huì)核準(zhǔn)［SYXK(軍)2002-011］，實(shí)施于海軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.3 CT引導(dǎo)下制備犬椎間盤(pán)退變模型 將犬腰1-2(L1-2)、腰3-4(L3-4)及腰5-6(L5-6)椎間盤(pán)納入退變模型制備實(shí)驗(yàn)研究，并行隨機(jī)分組。A組使用18號(hào)活檢槍;B組使用20號(hào)活檢槍;C組使用24號(hào)活檢槍。

使用氯胺酮(10 mg/kg)和咪達(dá)唑侖(0.5 mg/kg)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)后，對(duì)犬左側(cè)腰背部皮膚進(jìn)行備皮，顯露皮膚面積30 cm×15 cm，并放置定位線，行犬腰椎薄層 CT掃描(層厚0.625 mm)，三維重建顯示犬腰1椎體至腰7椎體。確定L1-2、L3-4及L5-6椎間盤(pán)平面后，根據(jù)定位線位置確定入針角度、深度及入針點(diǎn)。定位完成后，退出檢查床，移除定位線，于入針點(diǎn)周圍5 cm×5 cm區(qū)域內(nèi)行碘伏消毒(3次)，鋪洞巾，根據(jù)已確定入針點(diǎn)、入針角度及深度，使用活檢槍行經(jīng)皮椎間盤(pán)穿刺。出現(xiàn)突破感后，停止穿刺，CT掃描確定活檢槍位置位于椎間盤(pán)內(nèi)后，撤出活檢槍1 cm，同時(shí)推出活檢取材針芯，鉗取椎間盤(pán)髓核組織，電子天平稱重。以此方法分別使用不同型號(hào)活檢針對(duì)各組間盤(pán)進(jìn)行穿刺鉗取髓核組織操作。失血量、操作時(shí)間、鉗取髓核組織重量及術(shù)中、術(shù)后并發(fā)癥均詳細(xì)記錄。6只動(dòng)物均在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行穿刺。

術(shù)后4周及12周分別行核磁及數(shù)字平片檢查，評(píng)估各組椎間盤(pán)高度變化及髓核含水量狀態(tài);于術(shù)后12周處死動(dòng)物，收集各組樣本行組織學(xué)分析。

1.4 影像學(xué)分析 基于數(shù)字X線影像學(xué)技術(shù)，椎間盤(pán)高度變化使用“三中線法”進(jìn)行測(cè)定［7］。于犬腰椎側(cè)位數(shù)碼X線片上確定實(shí)驗(yàn)節(jié)段，確定包含實(shí)驗(yàn)椎間盤(pán)的最上端及最下端椎體，本實(shí)驗(yàn)為腰1椎體至腰6椎體，設(shè)定腰1椎體最上端前緣及后緣及腰椎體最下端前緣及后緣為標(biāo)志點(diǎn)，分別于椎體前后緣繪制平行直線 (圖1)。將2條平行線的之間距離等分3份，分別另行繪制直線A、B和C。3條直線分別于椎間盤(pán)上下緣與椎體交匯，形成D、E和F線段，通過(guò)電腦軟件(Photoshop 7.0，Adobe)對(duì)線段D、E和F進(jìn)行測(cè)量，取平均值(D+E+F)/3。

圖1 三中線法測(cè)量椎間盤(pán)高度

MRI中，T2加權(quán)像可反映組織中的水化狀態(tài)，在本實(shí)驗(yàn)中，用于連續(xù)、無(wú)創(chuàng)觀察髓核含水量的變化，間接反映椎間盤(pán)退變程度。使用Photoshop軟件工具，獲得T2相椎間盤(pán)灰度值，與相同節(jié)段水平腦脊液線灰度進(jìn)行對(duì)比，獲得標(biāo)準(zhǔn)化相對(duì)灰度指數(shù)(relative grayscale index，RGI)［8］。數(shù)據(jù)測(cè)量由經(jīng)驗(yàn)豐富的2名獨(dú)立觀察人員完成，并分別記錄。

1.5 組織學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于術(shù)后觀察3個(gè)月。

到達(dá)觀察期后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在麻醉狀態(tài)下處死，獲得各組椎間盤(pán)樣本，包括髓核、纖維環(huán)、上下軟骨終板和少量終板下骨。樣本組織浸泡于福爾馬林溶液(4%甲醛)1周后，放入脫鈣液(20%EDTA)中進(jìn)行脫鈣處理1個(gè)月。終板下骨軟化后，進(jìn)行脫水、石蠟包埋。于石蠟切片機(jī)上，切去6 μm厚組織切片行蘇木素和伊紅染色(hematoxylin and eosin，HE)，分別顯示細(xì)胞構(gòu)成及蛋白多糖含量變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 16.0軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后基本情況 在椎間盤(pán)退變模型制備過(guò)程中，每組取出髓核組織量分別為A組(3.0±0.53)mg、B組(2.01±0.34)mg和 C組(3.0±0.53)mg;平均操作時(shí)間為1.4 h;出血量為5～10 ml。有2只動(dòng)物在術(shù)中及術(shù)后均出現(xiàn)程度不一的神經(jīng)損害征象，顯示左側(cè)后肢跛行。其中，1只動(dòng)物跛行狀態(tài)在術(shù)后2周后逐漸緩解;另1只動(dòng)物于觀察期滿后，跛行狀態(tài)仍未見(jiàn)明顯改善。術(shù)后無(wú)明顯感染跡象發(fā)生。經(jīng)過(guò)3個(gè)月的觀察期，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于麻醉狀態(tài)下處死，每組獲得實(shí)驗(yàn)樣本6個(gè)(表1)。

表1 樣本數(shù)量分布

2.2 椎間盤(pán)高度 數(shù)字X線數(shù)據(jù)采集于術(shù)前、術(shù)后4周及術(shù)后12周，共3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(圖2)。術(shù)前椎間盤(pán)高度數(shù)測(cè)量做為基線，3組間高度無(wú)明顯差別(P＞0.05)。術(shù)后3組椎間盤(pán)高度均有不同程度降低，但組內(nèi)差異及同一時(shí)間點(diǎn)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖2 椎間盤(pán)高度變化

2.3 椎間盤(pán)相對(duì)灰度指數(shù) 矢狀位髓核中心MRI資料采集于術(shù)前、術(shù)后4周及術(shù)后12周，共3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(圖3)。術(shù)后第4周，3組中，RGI與術(shù)前對(duì)比，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P＞0.05)。術(shù)后第12周，A組RGI出現(xiàn)明顯下降，與B組和C組相比，下降程度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B組與C組間，RGI下降程度無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。與術(shù)前相比，術(shù)后第12周A組和B組降低程度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而C組RGI降低程度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)合改良Pfirrmann分級(jí)，在第12周時(shí)，A組椎間盤(pán)髓核信號(hào)明顯降低，椎間盤(pán)高度降低接近30%，可歸為5～6級(jí);B組椎間盤(pán)髓核信號(hào)雖有降低，但明顯高于椎間盤(pán)纖維環(huán)外層信號(hào)強(qiáng)度，可歸為3～4級(jí);C組椎間盤(pán)髓核信號(hào)無(wú)明顯改變，接近腦脊液強(qiáng)度，高度亦無(wú)改變，歸為1級(jí)。

圖3 椎間盤(pán)相對(duì)灰度指數(shù)

2.4 組織病理學(xué)檢查 術(shù)后12周，獲取椎間盤(pán)組織樣本行組織學(xué)染色及分析。HE染色顯示，A組內(nèi)終板結(jié)構(gòu)較為完好，但髓核含量下降，類軟骨樣髓核細(xì)胞明顯減少，取而代之的是體積較小、基質(zhì)分泌功能低下的軟骨細(xì)胞。且內(nèi)層纖維環(huán)結(jié)構(gòu)松散，髓核基質(zhì)中蛋白多糖含量下降，終板與髓核組織交接區(qū)域可見(jiàn)纖維結(jié)締組織形成(圖4A)，退變程度處于ThompsonⅢ級(jí)。B組椎間盤(pán)髓核含量無(wú)明顯改變，HE染色顯示深藍(lán)色，髓核內(nèi)蛋白多糖成分含量較高。HE染色顯示髓核內(nèi)細(xì)胞數(shù)量較多，體積大;終板結(jié)構(gòu)完整，終板內(nèi)軟骨細(xì)胞無(wú)明顯增生;但終板組織延伸入纖維環(huán)結(jié)構(gòu)及髓核組織內(nèi)，椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)開(kāi)始改變(圖4B)，退變程度處于ThompsonⅡ級(jí)。C組內(nèi)髓核組織、纖維環(huán)及終板結(jié)構(gòu)完整，類軟骨樣髓核細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖含量豐富，無(wú)明顯椎間盤(pán)退行性改變(圖4C)。

圖4 組織學(xué)分析(上圖×10，下圖×40)

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CT引導(dǎo)下經(jīng)皮髓核鉗取技術(shù)可誘導(dǎo)犬椎間盤(pán)退變的出現(xiàn)。經(jīng)過(guò)影像學(xué)及組織學(xué)分析，20號(hào)活檢槍可適合于制備退變較為緩和、重復(fù)性高的椎間盤(pán)退變模型。盡管18號(hào)活檢槍亦可誘發(fā)椎間盤(pán)退變，并且無(wú)急性髓核突出，但椎間盤(pán)退變速度較快，程度較為嚴(yán)重。經(jīng)過(guò)18號(hào)活檢槍處理后，椎間盤(pán)在術(shù)后3個(gè)月內(nèi)，髓核MRI T2信號(hào)降低超過(guò)50%，同時(shí)終板結(jié)構(gòu)也有改變，改良Pfirrmann分級(jí)至5～6級(jí)，可歸為中晚期退變，不適用于椎間盤(pán)退行性疾病治療方法的模型，尤其不適用于生物治療。與之相反，在24號(hào)活檢槍組中，椎間盤(pán)內(nèi)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組成均無(wú)明顯異常改變，這可能需要較長(zhǎng)的觀察期，故亦不是良好的椎間盤(pán)退變模型。

由學(xué)者Lipson等［9-10］描述的經(jīng)典纖維環(huán)損傷模型，是使用11號(hào)刀片對(duì)纖維環(huán)進(jìn)行全層損傷。在損傷后4周，髓核組織即被纖維軟骨樣組織所替代。這可能是由于損傷后，應(yīng)力作用使髓核組織的通過(guò)損傷通道發(fā)生急性突出，周圍軟骨細(xì)胞、纖維環(huán)細(xì)胞增生修復(fù)形成纖維軟骨樣組織［11-13］。本實(shí)驗(yàn)中，雖然各組移除髓核組織質(zhì)量不同，但在術(shù)后4周復(fù)查核磁可見(jiàn)各組間髓核組織水合程度無(wú)明顯差異。可能有以下3點(diǎn)原因:①髓核鉗取量較少，MRI無(wú)法檢測(cè);②髓核鉗取區(qū)域并非位于椎間盤(pán)中央矢狀位平面;③術(shù)后無(wú)明顯急性椎間盤(pán)髓核突出發(fā)生。盡管如此，在A組中，位于纖維環(huán)內(nèi)通向髓核的活檢槍通道，在大體標(biāo)本中仍清晰可見(jiàn)，其間由纖維結(jié)締組織填充。提示在纖維環(huán)損傷模型中，椎間盤(pán)髓核組織有可能會(huì)發(fā)生慢性突出。在一項(xiàng)關(guān)于豬的退變椎間盤(pán)體外生物力學(xué)研究中，Wang等［13］發(fā)現(xiàn)當(dāng)穿刺針型號(hào)超出22號(hào)，椎間盤(pán)髓核出現(xiàn)不可控的泄漏概率明顯增加。在本研究中18號(hào)和20號(hào)活檢槍實(shí)驗(yàn)組髓核泄漏發(fā)生率較低，可能是由于:①髓核鉗取后，椎間盤(pán)內(nèi)壓力降低;②樣本數(shù)量較少;③物種間的差異。

CT導(dǎo)航技術(shù)在制備椎間盤(pán)退變的應(yīng)用中，可有效降低主觀偏倚引發(fā)的椎間盤(pán)節(jié)段定位錯(cuò)誤。開(kāi)放性手術(shù)中，椎間盤(pán)節(jié)段定位多利用下端的髂骨翼和(或)上端的末節(jié)肋椎關(guān)節(jié)解剖結(jié)構(gòu)［14］。物種內(nèi)差異或各體變異可增加此種定位方式失敗概率;使用較大的手術(shù)切口充分顯露上、下端的解剖結(jié)構(gòu)，增加胸膜損傷及大出血的風(fēng)險(xiǎn)，也會(huì)延長(zhǎng)動(dòng)物術(shù)后康復(fù)時(shí)間。另外，側(cè)臥位時(shí)，動(dòng)物呈弓形狀態(tài)，各節(jié)段椎間盤(pán)并非平行排列，借助CT導(dǎo)航技術(shù)，穿刺入針點(diǎn)，入針角度及深度均可以得到保障，而避免不必要的損傷;直視下，操作者需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)提供相對(duì)正確的穿刺通道，保證穿刺針垂直進(jìn)入纖維環(huán)，而不傷及終板組織。在本研究中，A組有1例發(fā)生椎間盤(pán)終板損傷，提示除了髓核泄漏，穿刺針的型號(hào)過(guò)大還可增加終板損傷概率。

在本研究中我們提出一項(xiàng)較為直觀、可量化的指標(biāo)——髓核鉗取質(zhì)量，用于預(yù)測(cè)和評(píng)估椎間盤(pán)退變進(jìn)程，增強(qiáng)動(dòng)物模型制備的可重復(fù)性。該研究中，在制備椎間盤(pán)退變模型時(shí)，將鉗取出的髓核組織進(jìn)行稱重，分別為A組(3.00±0.53)mg、B組(2.01±0.34)mg和C組(3.00±0.53)mg。將其與模型制備后12周時(shí)的MRI對(duì)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行相關(guān)性分析，得出兩者成負(fù)相關(guān)的結(jié)果(r=－0.766)。雖然活檢槍的直徑對(duì)椎間盤(pán)退變進(jìn)程也存在一定的影響，但是這一結(jié)果為我們進(jìn)一步探討椎間盤(pán)退變可控性動(dòng)物模型制備提供了新的思路。但是鉗取髓核治療指標(biāo)也存在不足之處，不同動(dòng)物間及相同動(dòng)物不同節(jié)段間，髓核含量均不相同，鉗取相同的髓核量也可導(dǎo)致不同程度的退變。鉗取髓核治療與間盤(pán)整體髓核質(zhì)量之比可能是更好的指標(biāo)，但是目前仍無(wú)有效手段可對(duì)活體內(nèi)椎間盤(pán)髓核質(zhì)量進(jìn)行無(wú)創(chuàng)化測(cè)定。

目前，常用的纖維環(huán)損傷模型多是通過(guò)控制穿刺深度或穿刺后真空抽吸時(shí)間來(lái)保證椎間盤(pán)退變動(dòng)物模型制備的可靠性及可重復(fù)性。分析認(rèn)為:纖維環(huán)針刺退變模型的制備需要的穿刺針直徑應(yīng)大于40%椎間盤(pán)高度［15］。在一項(xiàng)關(guān)于大鼠椎間盤(pán)退變模型研究中［16］，21號(hào)皮下注射針被用于制作纖維環(huán)損傷，并且控制損傷深度于5 mm，避免椎間盤(pán)的結(jié)構(gòu)急性改變及由此引發(fā)的創(chuàng)傷性椎間盤(pán)退變。但是大型號(hào)的穿刺針可增加髓核泄漏及終板損傷概率，因此需要在誘發(fā)椎間盤(pán)退變與更為合理的穿刺針型號(hào)選擇中尋求平衡。本研究中使用的活檢槍型號(hào)由18～24號(hào)，口徑為1.2 mm至0.55 mm，占犬椎間盤(pán)高度的8%～17%。盡管口徑尚未達(dá)到椎間盤(pán)高度40%，在A組的1例樣本中仍出現(xiàn)了髓核泄漏現(xiàn)象。Sakai等［17］在探索制備兔椎間盤(pán)退變針刺模型研究中，使用21號(hào)針頭，連接10 ml注射器，在針頭穿刺進(jìn)入椎間盤(pán)髓核組織后，在一定時(shí)間內(nèi)保持注射器內(nèi)負(fù)壓狀態(tài)，對(duì)髓核組織進(jìn)行抽吸。然而隨后的實(shí)驗(yàn)研究證明，這種髓核抽吸方式引發(fā)的椎間盤(pán)退變速度過(guò)快，程度過(guò)于嚴(yán)重［7］。本研究使用活檢槍鉗取少量的髓核組織，實(shí)驗(yàn)組B組，使用20號(hào)活檢槍，在術(shù)后第12周，影像學(xué)顯示MRI T2信號(hào)輕度降低;組織學(xué)顯示椎間盤(pán)內(nèi)結(jié)構(gòu)基本完整，內(nèi)側(cè)纖維環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，髓核內(nèi)蛋白多糖含量無(wú)明顯降低。我們認(rèn)為該組椎間盤(pán)基本處于退變?cè)缰衅?，更適合于椎間盤(pán)退變模型制備。

椎間盤(pán)退變的生物治療需要處于早中期退變的動(dòng)物模型。在本研究中，雖然A組的椎間盤(pán)高度在3個(gè)月的觀察期內(nèi)未有明顯降低，但其MRI T2信號(hào)提示該組椎間盤(pán)退變處于中晚期改變。我們考慮，影像學(xué)結(jié)果差異可能是由于犬脊柱受力方式不同于人類，犬的脊柱很少受到軸向壓力，使得椎間盤(pán)高度變化滯后于髓核含水量的變化。由于A組椎間盤(pán)上下終板出現(xiàn)異常改變，提示椎間盤(pán)營(yíng)養(yǎng)通道受損，可能嚴(yán)重干擾生物治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，18號(hào)活檢槍不適于犬椎間盤(pán)退變模型的制備。

CT導(dǎo)航下髓核鉗取技術(shù)僅適用于體型較大的哺乳動(dòng)物(犬、羊)。因?yàn)樵诨顧z槍穿刺進(jìn)入椎間盤(pán)后需要保證活檢針芯完全進(jìn)入髓核組織區(qū)域，以保證每次鉗取髓核質(zhì)量保持一致。另外，由于犬可分為軟骨缺陷型及非軟骨缺陷型兩類，1歲齡的兩種犬內(nèi)具有不同髓核結(jié)構(gòu)及細(xì)胞成分，鉗取髓核組織不具有可比性，因此本研究均使用非軟骨缺陷型雜種犬。另外，本研究選取間隔節(jié)段間盤(pán)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以避免相鄰間盤(pán)退變誘發(fā)的“臨椎效應(yīng)”。學(xué)者Sobajima等［18］，在椎間盤(pán)退變研究中發(fā)現(xiàn)，在退變節(jié)段的相鄰節(jié)段椎間盤(pán)亦出現(xiàn)核磁信號(hào)的降低。該現(xiàn)象并未在本研究中出現(xiàn)，可能歸結(jié)于:①較短的觀察期;②間隔節(jié)段退變，分散應(yīng)力分布。

雖然該技術(shù)降低了出血風(fēng)險(xiǎn)及術(shù)中術(shù)后并發(fā)癥，但該技術(shù)受到定位準(zhǔn)確性、操作技術(shù)的限制，操作時(shí)間與開(kāi)放手術(shù)有明顯差異。犬的皮膚與皮下組織結(jié)合較為疏松，在穿刺時(shí)可能活檢槍在進(jìn)入皮下組織后可能出現(xiàn)偏移，影響穿刺準(zhǔn)確性，并延長(zhǎng)穿刺時(shí)間，增加終板損傷概率，需要在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，提高操作技術(shù)完成學(xué)習(xí)曲線。此外，CT掃描對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的損害作用，需要在操作時(shí)做好防護(hù)工作。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)CT三維定位，經(jīng)皮穿刺進(jìn)入髓核組織，鉗取髓核組織，誘導(dǎo)椎間盤(pán)退變進(jìn)程的發(fā)生。研究證實(shí)在CT導(dǎo)航下可使用活檢槍制備犬椎間盤(pán)退變模型，并通過(guò)影像學(xué)及組織學(xué)分析證明20號(hào)活檢槍是制備犬椎間盤(pán)退變模型的理想選擇，為探索新的椎間盤(pán)退變生物治療治療方法奠定基礎(chǔ)。

［1］Hwang SL，Hwang YF，Lieu AS，et al．Outcome analyses of interbody titanium cage fusion used in the anterior discectomy for cervical degenerative disc disease［J］．J Spinal Disord Tech，2005，18(4):326-331．

［2］Chan DD，Khan SN，Ye X，et al．Mechanical deformation and glycosaminoglycan content changes in a rabbit annular puncture disc degeneration model［J］．Spine(Phila Pa 1976)，2011，36(18):1438-1445．

［3］Mwale F，Masuda K，Pichika R，et al．The efficacy of Link N as a mediator of repair in a rabbit model of intervertebral disc degeneration［J］．Arthritis Res Ther，2011，13(4):R120．

［4］Masuda K，Aota Y，Muehleman C，et al．A novel rabbit model of mild，reproducible disc degeneration by an annulus needle puncture:correlation between the degree of disc injury and radiological and histological appearances of disc degeneration［J］．Spine(Phila Pa 1976)，2005，30(1):5-14．

［5］Wei A，Williams LA，Bhargav D，et al．BMP13 prevents the effects of annular injury in an ovine model［J］．Int J Biol Sci，2009，5(5):388-396．

［6］Pombo F，Rodriguez E，Martin R，et al．CT-guided coreneedle biopsy in omental pathology［J］．Acta Radiol，1997，38(6):978-81．

［7］Kim KS，Yoon ST，Li J，et al．Disc degeneration in the rabbit:a biochemical and radiological comparison between four disc injury models［J］．Spine(Phila Pa 1976)，2005，30(1):33-37．

［8］Ruan D，He Q，Ding Y，et al．Intervertebral disc transplantation in the treatment of degenerative spine disease:a preliminary study［J］．Lancet，2007，369(9566):993-999．

［9］Lipson SJ，Muir H．1980 Volvo award in basic science．Proteoglycans in experimental intervertebral disc degeneration［J］．Spine(Phila Pa 1976)，1981，6(3):194-210．

［10］Lipson SJ，Muir H．Vertebral osteophyte formation in experimental disc degeneration．Morphologic and proteoglycan changes over time［J］．Arthritis Rheum，1980，23(3):319-324．

［11］Sheikh H，Zakharian K，De La Torre RP，et al．In vivo intervertebral disc regeneration using stem cell-derived chondroprogenitors［J］．J Neurosurg Spine，2009，10:265-272．

［12］Urban PG，Roberts S，Ralphs JR．The nucleus of the intervertebral disc from development to degeneration［J］．Am Zool，2000，40:53-61．

［13］Wang JL，Tsai YC，Wang YH．The leakage pathway and effect of needle gauge on degree of disc injury post anular puncture:a comparative study using aged human and adolescent porcine discs［J］．Spine(Phila Pa 1976)，2007，32(17):1809-1815．

［14］Kong MH，Do DH，Miyazaki M，et al．Rabbit Model for in vivo Study of Intervertebral Disc Degeneration and Regeneration［J］．J Korean Neurosurg Soc，2008，44(5):327-333．

［15］Elliott DM，Yerramalli CS，Beckstein JC，et al．The effect of relative needle diameter in puncture and sham injection animal models of degeneration［J］．Spine(Phila Pa 1976)，2008，33(6):588-596．

［16］Zhang H，Yang S，Wang L，et al．Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needlestab injury of the rat caudal spine:oaboratory investigation［J］．J Neurosurg Spine，2011，15(4):404-413．

［17］Sakai D，Mochida J，Iwashina T，et al．Differentiation of mesenchymal stem cells transplanted to a rabbit degenerative disc model:potential and limitations for stem cell therapy in disc regeneration［J］．Spine(Phila Pa 1976)，2005，30(21):2379-2387．

［18］Sobajima S，Kompel JF，Kim JS，et al．A slowly progressive and reproducible animal model of intervertebral disc degeneration characterized by MRI，X-ray，and histology［J］．Spine(Phila Pa 1976)，2005，30(1):15-24．

Computed tomography guided nucleus pulposus biopsy for canine intervertebral disc degeneration preparation:a radiology and histology

SHI Zhi-yuan，GU Tao，ZHANG Chao，WANG De-li，RUAN Di-ke
(Department of Orthopedics，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

ObjectiveTo apply a minimal invasive method in disc degenerative disease animal model preparation with biopsy gun assisted with CT scan，and evaluate the accuracy，efficiency of this process with radiology and histology analysis．MethodsThe canine intervertebral disc of lumbar 1-2，lumbar 3-4，and lumbar 5-6 was divided into 3 groups randomly．Group A:18 Gauge of biopsy gun，Group B:20 Gauge of biopsy gun，Group C:24 Gauge of biopsy gun．After the lumbar spine scanned with CT，a certain volume of nucleus pulposus tissue was removed by the biopsy gun．Radiology examination was carried out at preoperation，4 weeks and 12 weeks postoperation．Each sample was harvested at 12 weeks postoperation for histology evaluation．ResultsIn the percutaneous biopsy procedure，the weight of NP tissue was removed:(3.0±0.53)mg in Group A，(2.01±0.34)mg in Group B，and(0.99)±0.12 mg in Group C．During the observation period，no significant differences in disc height were found between groups at each time point(P＞0.05)．The signal intensity of MRI was reduced significantly(P＜0.05)in Group A when compared with Group C at 12 weeks，and decreased content of nucleus pulposus，the number of nucleus pulposus cells and the loose of annulus fibrous at the inner area was observed at both HE and Saforini-O staining in Group A at 12 weeks．ConclusionCT-guided percutaneous biopsy could be applied in intervertebral disc degeneration preparation of canine model．20 G biopsy gun would be the optimal choice in this procedure．

Disc degeneration;Relative grayscale index;Animal model

R681.5－332;R814.42

A

2095-3097(2012)01-0017-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2012.01.005

100048北京，海軍總醫(yī)院(石志遠(yuǎn)，顧 韜，張 超，王德利，阮狄克)

阮狄克，E-mail:ruandike@yahoo.com.cn

2012-06-12 本文編輯:馮 博)