Tssk1和Tssk2的克隆、表達及其在成熟精子中的分布與亞細(xì)胞定位

楊明華, 蘇金珠, 劉 軍, 李亞輝,2,*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 昆明 650201; 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 昆明 650201)

Tssk1和Tssk2的克隆、表達及其在成熟精子中的分布與亞細(xì)胞定位

楊明華1,#, 蘇金珠1,#, 劉 軍1, 李亞輝1,2,*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 昆明 650201; 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 昆明 650201)

睪丸特異性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Testis-Specific Serine/Threonine Kinases, TSSKs)可能在精子發(fā)生和(或)精子功能調(diào)節(jié)中起著重要作用, 該文研究克隆并表達了小鼠Tssk1和Tssk2基因, 純化得到了Tssk1和Tssk2蛋白激酶, 經(jīng)Western blotting分析, Tssk1和Tssk2皆存在于小鼠和人的成熟精子中。免疫組化的結(jié)果顯示，Tssk1分布于小鼠的頭部(頂體)及整個尾部, Tssk2主要分布在小鼠精子頭部頂體后的區(qū)域; 獲能前后的小鼠精子其Tssk1及Tssk2分布模式未發(fā)生改變, 小鼠Tssk2在誘發(fā)頂體反應(yīng)前后精子中的分布模式也無變化。然而, 原來存在于頂體的Tssk1在誘發(fā)頂體反應(yīng)后由于頂體的丟失而未能檢出其信號, 但尾部的信號不受影響。在人精子中, Tssk1分布區(qū)域為頸部及尾部, Tssk2則分布于赤道板的位置。研究結(jié)果提示，Tssk1和Tssk2可能對精子功能具有重要調(diào)節(jié)作用。

Tssk蛋白激酶; 睪丸特異性; 精子功能; 磷酸化

精子發(fā)生(spermatogenesis)是精原細(xì)胞在睪丸中經(jīng)過一系列的增殖、分化變形, 最終形成功能性精子的過程。精子發(fā)生是一個復(fù)雜而有規(guī)律的細(xì)胞分化過程, 但在所有哺乳動物中, 精子發(fā)生的過程基本一致, 都可分為這樣 3個時期：有絲分裂期(spermatocytogenesis)、減數(shù)分裂期(spermatidogenesis)和精子形成期(spermiogenesis)。其中, 精子形成期是精子細(xì)胞的分化變態(tài)過程, 是精子分化的重要環(huán)節(jié)(Yang et al, 2005)。其間, 圓形的精子細(xì)胞(spermatids)發(fā)生劇烈的形態(tài)變化, 包括細(xì)胞伸長、細(xì)胞核的濃縮變長、頂體的形成、染色質(zhì)的濃縮重組、核蛋白的轉(zhuǎn)型、鞭毛、軸絲的發(fā)生及尾的成形分化等。這些顯著變化是由精子形成期所進行的基因轉(zhuǎn)錄(Hecht,1988)和蛋白質(zhì)翻譯(Hake et al, 1990)來調(diào)控的,有些在精子細(xì)胞中翻譯合成的蛋白質(zhì)會一直保留至成熟精子中。由于后者是高度分化的特異細(xì)胞, 其染色質(zhì)高度濃縮, 既不進行基因轉(zhuǎn)錄，也不能進行蛋白質(zhì)的翻譯合成, 細(xì)胞活動的調(diào)控幾乎都是通過蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式進行。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾及其活性與功能調(diào)節(jié)的重要方式之一, 已表明蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化作用在精子細(xì)胞的分化變態(tài)中起著不可缺少的作用, 有多種蛋白激酶參與精子發(fā)生的調(diào)節(jié)(Sassone-Corsi, 1997)。但是, 僅有少數(shù)幾種蛋白激酶特異表達于雄性生殖細(xì)胞或睪丸中(Johnson, 2009; Nayak et al, 1998; Shalom & Don,1999; Toshima et al, 1998, 1999; Tseng et al, 1998;Walden & Cowan, 1993)。睪丸特異性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Testis-Specific Serine/Threonine Kinases,TSSKs)即是這類蛋白激酶中的一個主要類群。Bielke et al (1994)發(fā)現(xiàn)首個TSSKs家族成員——小鼠Tssk1, 它是通過簡并寡核苷酸引物PCR分離出的一種編碼新的絲/蘇氨酸蛋白激酶的 cDNA片段,其表達產(chǎn)物能專一地識別睪丸中的兩個轉(zhuǎn)錄本(1.6 kb和1.4 kb)。隨后, Kueng et al (1997)以Tssk1基因為探針, 經(jīng)非嚴(yán)格雜交克隆并描述了小鼠Tssk2基因的分子特征, 并在此基礎(chǔ)上通過酵母雙雜交系統(tǒng)識別出小鼠 Tssk1和 Tssk2的一個作用底物——TSKS。Zuercher et al (2000)及 Visconti et al (2001)采用類似的PCR方法分別克隆出小鼠和人的Tssk3基因。Hao et al (2004)利用 PCR技術(shù)擴增出人的Tssk1-Tssk3以及Tssk1和Tssk2的作用底物TSKS,并且, 他們及其他研究人員(Spiridonov et al, 2005;Zuercher et al, 2000)通過對人和小鼠基因組的BLAST搜索發(fā)現(xiàn)了Tssk4和Tssk6。到目前為止, 已鑒定和克隆了 TSSKs家族的 5個成員(即 Tssk1、Tssk2、Tssk3、Tssk4 和 Tssk6), 隨后進行的 Northern blotting的研究結(jié)果顯示，TSSKs家族成員僅在睪丸中表達(Chen et al, 2005; Hao et al, 2004; Visconti et al, 2001; Zuercher et al, 2000)。但是, 有報道表明，定量RT-PCR的結(jié)果顯示Tssk1和Tssk2除了在睪丸中豐富表達外, 在其他組織中也有少量表達, 至于這種低水平的表達是否具有明顯的生理學(xué)意義卻不得而知(Spiridonov et al, 2005)。而所有TSSKs家族成員的 mRNA在睪丸中的表達量均高于其他組織, 并且小鼠TSSKs的轉(zhuǎn)錄物在出生后24 d的表達量與其在成年小鼠睪丸中的表達量相同, 這說明各TSSKs家族成員在小鼠睪丸中的mRNA都是在減數(shù)分裂后表達的(Li et al, 2011)。另外, Kueng et al(1997)利用酵母雙雜交系統(tǒng)從小鼠睪丸 cDNA文庫中篩選到一個能與Tssk1和Tssk2相互作用的蛋白質(zhì)——TSKS, 該蛋白(相對分子質(zhì)量約為 6.5×104)也專一表達于睪丸組織并可被Tssk1和Tssk2磷酸化。Visconti et al( 2001)用同樣的方法發(fā)現(xiàn)Tssk3在人的睪丸中特異表達。Zuercher et al(2000)的研究表明，Tssk3表達于睪丸間質(zhì)細(xì)胞, 但在附睪或精子中卻不表達, 經(jīng)Western blotting檢測, Tssk3蛋白的表達也與其基因的表達模式一致。TSSKs這種高度的組織和時間表達特異性提示它們可能在精子發(fā)生和(或)精子功能調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用(Bielke et al,1994; Hao et al, 2004; Kueng et al, 1997; Nayak et al,1998; Spiridonov et al, 2005; Visconti et al, 2001)。的確, 初步的研究結(jié)果表明TSSK成員在正常精子的發(fā)生過程和受精中起關(guān)鍵作用。例如, 敲除Tssk6基因后, 雄性小鼠可產(chǎn)生形態(tài)上大體正常的精子,但精子不具備正常的受精功能(Spiridonov et al,2005); 敲除Tssk1和Tssk2基因同樣導(dǎo)致雄性不育,并表現(xiàn)為精子形態(tài)發(fā)生異常, 如不能形成長形精子細(xì)胞, 以及精子細(xì)胞中線粒體鞘嚴(yán)重受損等(Shang et al, 2007, 2010; Xu et al, 2008a, 2008b); 臨床上Tssks基因某些位點的單核苷酸突變也可能與男性不育癥相關(guān)(Su et al, 2008; Zhang et al, 2010)。盡管如此, 有關(guān) Tssks在成熟精子中的存在及其定位的研究鮮有報道, 而通過免疫組化法檢測精子執(zhí)行不同功能(未獲能、獲能、頂體反應(yīng))時Tssks亞細(xì)胞定位的研究目前尚未見報道。本研究結(jié)果顯示，Tssk1和 Tssk2均表達于成熟的小鼠精子和人精子中, 但兩者的表達部位不管在何物種都有明顯不同, 這是否暗示著它們在精子功能調(diào)節(jié)中具有不同的功能。本研究結(jié)果為進一步開展Tssks對精子功能的調(diào)節(jié)機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

7～8周齡的雄性ICR小鼠用于本實驗, 它們均來自中國科學(xué)院昆明動物研究所實驗動物中心。除特殊說明外, 所用的化學(xué)試劑均購自Sigma公司(St.Louis, MO, USA)。用于Western blotting 的聚丙烯酰胺(30%)為索萊寶公司產(chǎn)品, 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量marker 為碧云天公司產(chǎn)品, X光片為柯達公司產(chǎn)品; PVDF膜購自Millipore公司, 顯影粉和定影粉購自天津世紀(jì)奧博商貿(mào)有限公司, GST標(biāo)簽重組人Tssk1和Tssk2蛋白購自Abnova公司, 小鼠單克隆抗 Tssk1抗體(clone 4F12)和抗 Tssk2抗體(clone 1E12)購自 Abnova(臺灣)公司, Alexa-Fluor-555 二抗(羊抗鼠)、Alexa-Fluor-488 PNA、DAPI 均購自Invitrogen公司, HRP-抗鼠IgG抗體購自Abcam公司, 引物合成及 DNA測序在上海生工生物工程公司進行。

1.2 小鼠Tssk1 和Tssk2的克隆

1.2.1 小鼠睪丸總 RNA的抽提和 cDNA的合成總RNA的抽提采用TINGEN 公司的Trizol 試劑,將小鼠睪丸放入加有液氮的研缽中, 不斷研磨使成粉末, 待液氮揮發(fā)完以后, 按 50～100 mg組織/mL Trizol 加入Trizol, 室溫放置10 min, 使其充分裂解,12 000 r/min 離心 5 min, 棄沉淀; 按 200 μL 氯仿/mL Trizol加入氯仿, 振蕩混勻后室溫放置15 min,4℃, 12 000g離心15 min, 取上層水相于一新離心管中, 按0.5 mL異丙醇/mL Trizol加入異丙醇混勻,室溫放置5～10 min, 4℃, 12 000g離心10 min, 棄上清, 回收沉于管底的RNA, 按1 mL 75%乙醇/mL Trizol加入 75%乙醇, 溫和振蕩離心管, 懸浮沉淀,4 ℃, 8 000g離心5 min, 棄上清, 室溫晾干或真空干燥5～10 min。用無RNase 的滅菌水溶解沉淀, 取少許用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性, 其余的置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1 g 總RNA 用于cDNA 第一鏈的合成，合成步驟按Reverse Transcription System 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行，試劑盒購自TINGEN公司。所用引物系根據(jù)NCBI上NM_009435(Tssk1)和 NM_009436(Tssk2)的序列分別自行設(shè)計的Tssk1和Tssk2特異引物(Tssk1:Sense:5'-ATGTCTGGCAGGGATGTA G-3'Antisense:5'-GCTTCTTTAGCCGTGTGAG-3';Tssk2：Sense：5'-TGGGAATGAGGACAATGC-3',Antisense：5'-CTGCACACCACGATACCC-3')。RTPCR程序為：94 ℃預(yù)變性3 min; 94 ℃變性30 s, 55℃復(fù)性30 s, 72 ℃延伸90 s, 共進行35 個循環(huán); 72℃ 延伸10 min。反應(yīng)完畢后取2 μL 進行1% 瓊脂糖凝膠電泳分析。

用1%瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR 產(chǎn)物, 進行 TOPO TA 連接與轉(zhuǎn)化, 用藍白斑法挑選陽性克隆進行 PCR, 委托上海生工生物工程公司進行DNA 序列測定。

1.2.2 小鼠Tssk1和Tssk2的亞克隆及蛋白表達與純化 亞克?。簩y序完全正確的Tssks菌株培養(yǎng)后提取質(zhì)粒作為模板, 分別把Tssk1和Tssk2的開放閱讀框(ORF) 亞克隆進 PGEX-5X-1表達載體,所用的亞克隆引物分別為Tssk1引物：Sense： 5'-CC GGAATTCATGGATGACGCTGCCGTCC-3'(帶EcoRⅠ酶切位點)Antisense：5'-ATTTGCGGCCGCATCT AAGTATGTGTCTCTGAAGG-3'(帶 Not I酶切位點);Tssk2引物：Sense：5'-GAATTCATGGACGATGCG GCGGTCCTA-3'(帶 EcoRⅠ酶切位點), Antisense：5'-GTCGACTCCTAGGTACTTGCTTTCTCCAC-3'(帶Sal I酶切位點)。PCR程序為：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 sec, 55 ℃復(fù)性30 sec, 72 ℃延伸90 s,共進行35 個循環(huán); 72 ℃ 延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR 產(chǎn)物, 進行TOPO TA 連接與轉(zhuǎn)化, 挑選陽性克隆進行PCR,提取其質(zhì)粒, 對目的片段及表達載體(pGEX-5X-1)進行酶切, 然后用T4連接酶將其連接(16 ℃連接過夜)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌后用藍白斑篩選, 搖菌后進行菌液 PCR,陽性結(jié)果樣品, 一部分用于測序(委托上海生工生物工程公司進行), 剩下的用甘油冷凍保存于－80℃冰箱。

蛋白表達與純化：將測序正確的菌株提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化到BL21, 用IPTG誘導(dǎo)Tssks蛋白的表達, 菌液于4 ℃, 3 000g離心10 min, 棄上清。用預(yù)冷的1×PBS(pH8.0)重懸菌體(3 mL PBS/50 mL菌液), 4℃, 3 000g離心10 min, 棄上清。加入預(yù)冷PBS(含PMSF和 EDTA), 用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞,超聲處理3次, 每次30 s。4 ℃, 12 000離心10 min,將上清轉(zhuǎn)移至一新離心管中, 加入預(yù)冷PBS后上柱,平衡后用20倍柱床體積的含有PMSF的1xPBS進行清洗。然后用10～15倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫液(0.154 g還原型谷胱甘肽溶解于50 mL 50 mmol/L的Tris-HCl, pH8.0)洗脫GST融合蛋白。洗脫4次,分別收集4次洗脫液, 進行Western blotting分析。

1.3 小鼠和人精子的制備

將性成熟的ICR小鼠脫頸處死, 取附睪尾并在其上剪幾個開口, 將剪過的附睪置于 Whitten’s 液中, 37 ℃水浴處理10 min讓精子游出來, 取少許鏡檢、計數(shù), 其余精子用做獲能、頂體反應(yīng)、免疫組化、Western blotting等實驗。精子獲能參照Visconti et al (1995)報道的方法進行, 即：將洗滌后的精子置于成分完全的Whitten’s 液中, 于37 ℃孵育90 min;頂體反應(yīng)的誘發(fā)：洗滌后的精子于37 ℃ Whitten’s液中孵育 60 min 后, 加入 10 μmol/L Ca2+載體A23187 再孵育30 min 即可 。人精液先經(jīng)液化處理1 h, 然后在37 ℃的mHTF溶液中上游1 h, 離心洗滌后用于免疫組化或Western blotting分析。

1.4 SDS-PAGE和Western blotting分析

在細(xì)胞或精子提取物中加入適量的Laemmli緩沖液, 煮沸5 min, 13 000 r/min, 離心5 min。將上清轉(zhuǎn)至新離心管中, －20 ℃或－80 ℃保存?zhèn)溆?。電泳前加?%的β-巰基乙醇煮沸2 min, 在12%分離膠, 5%濃縮膠中進行SDS-PAGE電泳, 每個泳道精子量為1×106～2×106。電泳結(jié)束后, 將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上, 用含5%脫脂乳的T-TBS室溫下封閉1 h (Jha et al, 2006), 分別與一抗、二抗孵育后用ECL顯色。

1.5 小鼠和人精子免疫熒光染色

小鼠或人精子經(jīng)處理、洗滌后將其加于載玻片上的小孔中, 晾干后用 3.7%的甲醛于室溫下固定20 min, 用含有0.1%Tween20的PBS洗3次, 每次5 min。 用含0.5%Triton X-100的PBS透膜5 min(室溫)。用含有0.1%Tween20的PBS洗 3次, 每次5 min。

用封閉液(含有10%BSA的PBS)封閉(室溫2 h或在濕盒里4 ℃過夜)。加入相應(yīng)的一抗(室溫下結(jié)合2 h, 或在濕盒里4 ℃過夜)。PBS洗3次, 每次10 min。加入二抗及PNA和DAPI, 室溫孵育至少2 h。PBS洗10次, 每次2 min。去除多余液體后封片,放4 ℃避光過夜。次日鏡檢, 拍照。以添加二抗而不添加一抗的精子作為陰性對照組, 檢測二抗的假陽性情況。免疫標(biāo)記的精子用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠Tssk1和Tssk2蛋白表達及提取純化

在成功克隆出小鼠Tssk1和Tssk2的基礎(chǔ)上, 本研究建立了小鼠Tssk1和Tssk2蛋白的原核表達體系, 用谷胱甘肽樹脂提取純化了帶有GST標(biāo)簽的重組小鼠Tssk1和Tssk2蛋白, 經(jīng)Western blotting檢測, 在第一次和第二次洗脫液中檢出相對分子質(zhì)量為 6.6×104～6.7×104的蛋白分子, 與預(yù)期的GST-Tssk1和GST-Tssk2 相對分子質(zhì)量一致(圖1)。

圖1 小鼠Tssk1(A)和Tssk2(B)蛋白提取純化Fig. 1 Purified mouse Tssk1(A) and Tssk2 (B) protein

2.2 小鼠Tssk1和Tssk2蛋白免疫印跡分析

如圖2 所示, 抗Tssk1的抗體不但能識別重組小鼠Tssk1蛋白, 而且還能識別重組小鼠Tssk2蛋白,此外, 經(jīng)Western blotting分析, 在成熟的小鼠精子中有 Tssk1蛋白的存在; 圖 2 B 的結(jié)果顯示, 抗Tssk2的抗體既能識別重組小鼠Tssk2蛋白, 又能識別重組小鼠Tssk1蛋白, 而且, 用抗Tssk2的抗體在成熟小鼠精子中檢測到2種蛋白, 其中之一可能是Tssk2蛋白激酶翻譯后修飾的一種形式。如圖 2 A和 B所示, 抗 Tssks的抗體能同時識別小鼠重組Tssk1和Tssk2, 很可能是由于Tssk1和Tssk2有較高同源性之故。

圖2 小鼠Tssk1(A)和Tssk2(B)蛋白免疫印跡分析Fig. 2 Western blotting of mouse Tssk1(A) andTssk2(B)

2.3 人Tssk1和Tssk2蛋白免疫印跡分析

Western blotting的結(jié)果顯示, Tssk1和Tssk2蛋白分別存在于射出的人精子中(圖 3), 而且, 與小鼠的情況不同, 抗 Tssks的抗體只能識別相應(yīng)的重組人Tssk蛋白(圖 3)。像小鼠一樣, 用抗 Tssk2的抗體在射出的人精子中檢測到2種蛋白(圖 3 B)。

2.4 Tssk1和Tssk2在小鼠和人精子中的亞細(xì)胞定位

2.4.1 Tssk1和Tssk2在小鼠精子(未獲能、獲能和頂體反應(yīng))中的亞細(xì)胞定位 我們用免疫組化方法檢測了Tssk1和Tssk2在小鼠未獲能、獲能及頂體反應(yīng)精子中的分布與定位, 發(fā)現(xiàn) Tssk1主要分布于小鼠精子的頭部(頂體)和整個尾部且在獲能前后其分布模式未發(fā)生改變, 但原來存在于頂體的 Tssk1在頂體反應(yīng)后隨頂體的丟失而丟失(圖 4A)。Tssk2主要分布于小鼠精子頭部頂體后區(qū)域, 其分布模式在獲能前后、頂體反應(yīng)后均未發(fā)生改變(圖 4B)。

2.4.2 Tssk1和 Tssk2在人精子中的亞細(xì)胞定位經(jīng)免疫熒光檢測, Tssk1分布于人精子頸部及整個尾部(圖 5A), Tssk2則分布于人精子赤道板附近(圖

5B)。與小鼠精子一樣, 人精子中Tssk1和Tssk2 在獲能前后、頂體反應(yīng)后的分布模式也無改變(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖3 人Tssk1(A)和Tssk2(B)蛋白免疫印跡分析Fig. 3 Western blotting of human Tssk1(A) and Tssk2(B)

3 討 論

圖4 Tssk1(A)和Tssk2(B)在成熟小鼠精子中的亞細(xì)胞定位Fig. 4 Subcellular localization of Tssk1 (A) and Tssk2 (B) in mature mouse sperm

圖5 Tssk1(A)和Tssk2(B)在成熟人精子中的亞細(xì)胞定位Fig. 5 Subcellular localization of Tssk1(A) and Tssk2(B) in mature human sperm

迄今為止, 已鑒定和克隆了TSSKs家族的5個成員，即Tssk1、 Tssk2、 Tssk3、 Tssk4 和Tssk6。Northern blotting 的研究結(jié)果顯示，TSSKs家族成員僅在睪丸中表達(Visconti et al, 2001; Hao et al,2004; Zuercher et al, 2000; Chen et al, 2005)；但是,有報道表明定量 RT-PCR的結(jié)果顯示，Tssk1和Tssk2除了在睪丸中豐富表達外, 在其他組織中也有少量表達, 至于這種低水平的表達是否具有明顯的生理學(xué)意義卻不得而知(Spiridonov et al, 2005)。而所有TSSKs家族成員的mRNA在睪丸中的表達量均高于其他組織, 并且小鼠TSSKs的轉(zhuǎn)錄物在出生后 24 d的表達量與其在成年小鼠睪丸中的表達量相同, 這說明各TSSKs家族成員在小鼠睪丸中的mRNA都是在減數(shù)分裂后表達的(Li et al, 2011)。 Li et al (2011)的研究表明，Tssks的mRNA和蛋白在減數(shù)分裂后的精子細(xì)胞中均有表達, 提示這些蛋白激酶可能參與精子形成的調(diào)節(jié)過程。Li et al (2011)用多種抗體檢測了Tssks在小鼠和人成熟精子中的蛋白表達情況, 除Tssk3外, 其余Tssks蛋白在兩個物種的成熟精子中都有表達。本研究中只使用了抗Tssk1及 Tssk2的抗體來檢測它們在成熟的小鼠和人精子中的表達, 結(jié)果表明，Tssk1和Tssk2都表達于小鼠和人的成熟精子中, 此外, 抗 Tssk1的抗體不但能夠識別重組小鼠TSSK1, 而且還能識別重組小鼠的TSSK2, 很可能是兩者具有較高的同源性之故, 這與Li et al (2011)的結(jié)果一致；但是, Tssk2在小鼠中的情況卻與Li et al (2011)的不盡相同, 我們的Western blotting結(jié)果顯示，抗Tssk2抗體既能識別重組小鼠Tssk2,同時還能識別重組小鼠Tssk1, 而Li et al (2011)的報道中抗Tssk2抗體只能識別重組小鼠的Tssk2。我們用的抗體與Li et al (2011)所用的完全相同, 不同之處僅在于重組 Tssks蛋白的提取純化方法上, 但這似乎不能解釋產(chǎn)生抗體識別差異的原因, 具體原因有待進一步研究。用同樣的抗體我們在人精子中檢測到有Tssk1和Tssk2 的存在,并且, 與小鼠中的情況不同, 這兩種抗體都只識別一種相應(yīng)的人重組Tssk, 此結(jié)果與Li et al (2011)的報道完全一致。

在分析了Tssk1和Tssk2 在成熟精子中表達的基礎(chǔ)上, 我們采用免疫組化方法研究了這兩種蛋白激酶在精子中的分布與定位, 發(fā)現(xiàn) Tssk1存在于小鼠精子頂體及整個尾部；而Tssk2主要分布于頭部頂體后的區(qū)域, 研究結(jié)果與Li et al (2011)的報道一致。2009年, Sosnik et al (2009)報道小鼠精子上受精所必須的Izumo蛋白分子在頂體反應(yīng)中會發(fā)生遷移,這種遷移是成功受精的先決條件且與Tssk6密切相關(guān), 敲除Tssk6基因的雄性小鼠能產(chǎn)生精子, 但是不能完成正常受精。這說明精子中的一些蛋白分子在受精前的關(guān)鍵環(huán)節(jié)中會發(fā)生動態(tài)變化且與受精直接相關(guān), 因此, 我們檢測了 Tssk1 和 Tssk2在未獲能、獲能及頂體反應(yīng)的小鼠精子中的定位情況, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的分布模式未發(fā)生改變；經(jīng)分析, 人精子中Tssk1和Tssk2的情況也如此(數(shù)據(jù)未顯示)。在射出的人精子中, Tssk1分布于精子的頸部及尾部,Tssk2則分布于赤道板的位置。本研究中Tssk1的分布模式與Li et al (2011)的報道一致, Tssk2在人精子中的定位卻與其不同, 而和Hao et al (2004)的報道一致。需要指出的是, 3項研究中用于免疫組化分析的精子其遺傳、生殖力背景都不清楚, 因此, 我們認(rèn)為Tssk2的這種分布模式差異很可能與精子本身的差異有關(guān), 這是否也從另一個側(cè)面說明 Tssk2的亞細(xì)胞定位與人精子的內(nèi)在特性有關(guān)。果真如此的話, 我們就可以通過 Tssk2的分布模式來預(yù)測精子質(zhì)量及其受精能力。

通過本研究, 我們證明了Tssk1 和Tssk2存在于成熟的小鼠精子和人精子中, 它們在精子中的分布模式不盡相同, 由于精子是高度分化、區(qū)域化明顯的特異細(xì)胞, Tssks在精子中的不同空間分布圖示提示Tssk1和Tssk2可能對精子功能具有重要的調(diào)控作用,而且, 它們的調(diào)控作用及其機制可能各不相同。本研究結(jié)果顯示, 小鼠和人精子尾部都有Tssk1的存在, 似乎暗示著它與精子的運動性調(diào)控有關(guān); 除在尾部有分布外, Tssk1還分布于小鼠精子的頂體上, 但這是否說明它參與小鼠精子的頂體反應(yīng)還需要做進一步的研究。與小鼠精子中的情況稍有不同, 在本研究中僅在人精子頸部和尾部檢出Tssk1的信號, 而Li et al (2011)則報道像小鼠精子一樣, Tssk1存在于人精子的頭部(頂體)和尾部。因此, 本研究中觀察到不同于小鼠精子的 Tssk1在人精子中的分布模式很可能不是由于物種差異，而是由人精子樣本差異所造成的, 至于這種差異意味著什么則有待探明。與Tssk1的分布截然不同, Tssk2分別位于小鼠精子頭部頂體后區(qū)域和人精子頭部赤道板附近, 據(jù)Sosnik et al (2009)的報道, 這些區(qū)域聚合肌動蛋白較為豐富, 它們與精卵融合與受精直接相關(guān)；他們的研究表明，Tssk6基因敲除的雄鼠因其精子中肌動蛋白聚合受阻, 致使精子Izumo蛋白不發(fā)生遷移最終導(dǎo)致精卵融合與受精失敗。有意思的是, 我們發(fā)現(xiàn)在小鼠精子中 Tssk2的分布模式與 Tssk6的分布非常相似。因此, 我們推測, Tssk2很可能也與精子的頂體反應(yīng)有關(guān), 但這需要進行深入研究來證明, 人精子中 Tssk2的作用是否如此也有待研究。

已有的研究表明，TSSKs在動物(人)精子發(fā)生和(或)成熟精子功能發(fā)揮中起著重要的調(diào)控作用, 而且,Tssks基因敲除的小鼠除生殖力外, 其他表型都不受影響(Spiridonov et al, 2005; Xu et al,2008b), 對這類蛋白激酶的深入研究將有助于理解相關(guān)男性不育癥的發(fā)病機制, 并有望為男性非激素類避孕藥物的研發(fā)提供新思路。由于蛋白激酶已成為新藥研發(fā)的重要標(biāo)靶, 這暗示著可以將TSSKs作為研發(fā)非激素類男性避孕藥物的標(biāo)靶, 例如,TSSKs蛋白激酶的特異性抑制劑便是研發(fā)男用避孕藥物的理想候選物。進一步的工作需要進行TSSKs蛋白空間結(jié)構(gòu)的解析并抓緊尋找、設(shè)計TSSKs的抑制劑。

Bielke W, Blaschke RJ, Miescher GC, Zürcher G, Andres AC, Ziemiecki A.1994. Characterization of a novel murine testis-specific serine/threonine kinase [J].Gene,139(2):235-239.

Chen XJ, Lin G, Wei YH, Hexige S, Niu YJ, Liu LL, Yang CY, Yu L. 2005.TSSK5, a novel member of the testis-specific serine/threonine kinase family, phosphorylates CREB atSer-133, and stimulates the CRE/CREB responsive pathway [J].Biochem Biophys Res Commun,333(3): 742-749.

Hake LE, Alcivar AA, Hecht NB. 1990. Changes in mRNA length accompany translational regulation of the somatic and testis-specific cytochrome c genes during spermatogenesis in the mouse [J].Development,110: 249-257.

Hao ZL, Jha KN, Kim YH, Vemuganti S, Westbrook VA, Chertihin O,Markgraf K,Flickinger CJ, Coppola M, Herr JC, Visconti PE. 2004.Expression analysis of the human testis-specific serine/threonine kinase(TSSK) homologues. A TSSK member is presenting the equatorial segment of human sperm [J].Mol Hum Reprod,10(6): 433-444.

Hecht NB. 1988. Post-meiotic gene expression during spermatogenesis [J].Prog Clin BiolRes,267: 291-313.

Jha KN, Salicioni AM, Arcelay E, Chertihin O, Kumari S, Herr JC and Visconti PE.2006. Evidence for the involvement of proline-directed serine/threonine phosphorylation in sperm capacitation [J].Mol Hum Reprod,12:781-789.

Johnson LN. 2009. The regulation of protein phosphorylation [J].Biochem Soc Trans,37(4):627-641.

Kueng P, Nikolova Z, Djonov V, Hemphill A, Rohrbach V, Boehlen D,Zuercher G, Andres AC, Ziemiecki A. 1997. A novel family of serine/threonine kinases participating in spermiogenesis [J].J Cell Biol,139(7): 1851-1859.

Li YH, Sosnik J, Brassard L, Reese M, Spiridinov NA, Bates TC, Johnson GR, Anguita J, Visconti PE, Salicioni AM. 2011. Expression and localization of five members of the testis-specific serine kinase (Tssk)family in mouse and human sperm and testis [J].Mol Hum Reprod,17(1): 42-56.

Nayak S, Galili N, Buck CA. 1998. Immunohistochemical analysis of the expression of two serine-threonine kinases in the maturing mouse testis[J].Mech Dev,74(1-2): 171-174.

Sassone-Corsi P. 1997. Transcriptional checkpoints determining the fate of male germ cells [J].Cell,88(2): 163-166.

Shalom S, Don J. 1999.Tlk, a novel evolutionarily conserved murine serine threonine kinase, encodes multiple testis transcripts [J].Mol Reprod Dev,52(4): 392-405.

Shang P, Baarends WM, Dooijes D, Elfferich P, Wijgerde M, Ooms MP,Looijenga LH,Dohle GR, Van Eenennaam H, Gossen JA. 2007.Testis-specific serine/threonine kinases encoded by the retrogenes Tssk1 and Tssk2 are essential for spermatogenesis in mouse [C]// ASo A, ed. XIX North American Testis Workshop: "Chromosome Structure and Gene Expression". Tampa: Hyatt Regency, 115.

Shang P, Baarends WM, Hoogerbrugge J, Ooms MP, van Cappellen WA, de Jong AAW, DohleGR, van Eenennaam H, Gossen JA, Grootegoed JA.2010. Functional transformation of the chromatoid body in mouse spermatids requires testis-specific serine/threonine kinases [J].J Cell Sci,123(3): 331-339.

Sosnik J, Miranda PV, Spiridonov NA, Yoon SY, Fissore RA, Johnson GR,Visconti PE. 2009. Tssk6 is required for Izumo relocalization and gamete fusion in the mouse [J].J Cell Sci,122(15): 2741-2749.

Spiridonov NA, Wong L, Zerfas PM, Starost MF, Pack SD, Paweletz CP,Johnson GR. 2005. Identification and characterization of SSTK, a serine/threonine protein kinase essential for male fertility [J].Mol Cell Biol,25(10): 4250-4261.

Su D, Zhang W, Yang Y, Deng Y, Ma YX, Song HX, Zhang SZ. 2008.Mutation Screening and association study of theTSSK4gene in Chinese infertile men with impaired spermatogenesis [J].J Androl,29(4): 374-378.

Toshima J, Koji T, Mizuno K. 1998. Stage-specific expression of testis-specific protein kinase 1 (TESK1) in rat spermatogenic cells [J].Biochem Biophys Res Commun,249(1): 107-112.

Toshima J, Tanaka T, Mizuno K. 1999. Dual specificity protein kinase activity of testis-specific protein kinase 1 and its regulation by autophosphorylation of serine-215 within the activation loop.J Biol Chem,274(17): 12171-12176.

Tseng TC, Chen SH, Hsu YP, Tang TK. 1998. Protein kinase profile of sperm and eggs: cloning and characterization of two novel testis-specific protein kinases (AIE1, AIE2) related to yeast and fly chromosome segregation regulators [J].DNA Cell Biol,17(10):823-833.

Visconti PE, Bailey JL, Moore GD, Pan D, Olds-Clarke P, Kopf GS.1995.Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation [J].Development,121(4): 1129-1137.

Visconti PE, Hao ZL, Purdon MA, Stein P, Balsara BR, Testa JR, Herr JC,Moss SB, Kopf GS. 2001. Cloning and chromosomal localization of a gene encoding a novel serine/threonine kinase belonging to the subfamily of testis-specific kinases [J].Genomics,77(3): 163-170.

Walden PD, Cowan NJ. 1993. A novel 205-kilodalton testis-specific serine/threonine protein kinase associated with microtubules of the spermatid manchette [J].Mol Cell Biol,13(12): 7625-7635.

Xu BF, Hao ZL, Jha KN, Zhang ZB, Urekar C, Digilio L, Pulido S, Strauss JF III, Flickinger CJ, Herr JC. 2008a. TSKS concentrates in spermatid centrioles during flagellogenesis [J].Dev Biol,319(2): 201-210.

Xu BF, Hao ZL, Jha KN, Zhang ZB, Urekar C, Digilio L, Pulido S, Strauss JF III, Flickinger CJ, Herr JC. 2008b. Targeted deletion of Tssk1 and 2 causes male infertility due to haploinsufficiency [J].Dev Biol,319(2):211-222.

Yang ZM, Sun QY, Xia GL. 2005. Reproductive Biology [M]. Beijing:Science Press. [楊增明, 孫青原, 夏國良. 2005. 生殖生物學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社.]

Zhang H, Su D, Yang Y, Zhang W, Liu YQ, Bai G, Ma MY, Ma YX, Zhang SZ. 2010. Some single-nucleotide polymorphisms of the TSSK2 gene may be associated with human spermatogenesis impairment [J].J Androl,31(4): 388-392.

Zuercher G, Rohrbach V, Andres AC, Ziemiecki A. 2000. A novel member of the testis specific serine kinase family,tssk-3, expressed in the Leydig cells of sexually mature mice [J].Mech Dev,93(1-2): 175-177.

Cloning and expression of Tssk1 & Tssk2 in mice and the presence & localization of them in mature sperm

YANG Ming-Hua1,#, SU Jin-Zhu1,#, LIU Jun1, LI Ya-Hui1,2,*

(1.College of Animal Science & Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming650201,China;2.College of Food Science & Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming650201,China)

We sought to experimentally verify if testis specific serine/threonine kinases (Tssks) play a role in spermatogenesis and/or the regulation of sperm function. Purified Tssk proteins were obtained based on cloning and expression of mouse Tssk1 and Tssk2. Tssk1 and Tssk2 were detected in mature mouse and human sperm by western blotting. Immunofluorescence indicated that Tssk1 is distributed in the acrosome and the entire flagellum of mouse sperm while Tssk2 was mainly distributed in post-acrosomal region. There was no alteration in the distribution pattern of Tssk1 and Tssk2 in non-capacitated and capacitated sperm. Tssk2 distribution remained unchanged after induced acrosome reaction but no signals were detected in the acrosome for Tssk1, which was present before the acrosome reaction, though signals in flagellum were undisturbed. In human sperm, Tssk1 was found in neck and flagellum while Tssk2 was found in the equatorial region. Our results suggest Tssk1 and/or Tssk2 do play an important role(s) in the regulation of sperm function.

Tssk kinases; Testis-specific; Sperm function; Phosphorylation

Q954.434; Q78；Q555

A

0254-5853-(2012)04-0381-08

10.3724/SP.J.1141.2012.04381

2012-02-01；接受日期：2012-05-15

國家自然科學(xué)基金專項基金(31040055)

?通信作者(Corresponding author)，E-mail: liyh85@yahoo.com.cn#共同第一作者(Authors contributed equally to the work)