次氯酸鈉對(duì)葡萄葉片組培褐變率的影響

溫鵬飛，王 蓓，張建成，牛鐵泉，倉國營，邢延富

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801）

組織培養(yǎng)又稱離體培養(yǎng)，狹義地講，是指用植物各部分組織（如形成層、薄壁組織、葉肉組織、胚乳等）進(jìn)行培養(yǎng)獲得再生植株[1]。組織培養(yǎng)不僅可以快速繁殖優(yōu)良種苗，而且還可以培育脫毒苗木，保持其優(yōu)良性狀[2-3]。此外，組織培養(yǎng)也為育種提供了許多手段和方法，使育種工作能更有效地進(jìn)行[4-6]。在組織培養(yǎng)中，外植體滅菌是最關(guān)鍵的一步。大田的園藝作物常常帶有各種各樣的病菌，因而，在接種前一定要對(duì)其進(jìn)行徹底滅菌才可以保證后續(xù)試驗(yàn)的成功。一般生產(chǎn)實(shí)踐上，多用自來水反復(fù)沖洗，之后用不同的滅菌劑進(jìn)行殺菌，如酒精、次氯酸鈉和升汞等[7-9]。藥劑的濃度和滅菌時(shí)間決定了外植體的感染、褐化和愈傷組織的分化。藥劑濃度過大，滅菌時(shí)間過長(zhǎng)，超過了細(xì)胞的忍耐力，細(xì)胞就會(huì)褐變死亡；但時(shí)間和濃度如果過短過輕，則可能無法殺死外植體表面的細(xì)菌[10-11]。因而，尋求最佳的藥劑及其濃度和時(shí)間組合，控制外植體褐變率，是組培成功的關(guān)鍵。

葡萄葉片富含多酚類物質(zhì)，為避免其褐變率過高，往往需要進(jìn)行一些藥劑處理，如抗壞血酸和PVP 等[12]。在完整植物體的細(xì)胞中，酚類化合物和多酚氧化酶分隔存在，因而比較穩(wěn)定。當(dāng)外植體切割后，切口附近細(xì)胞的分隔效應(yīng)被打破，酚類化合物被多酚氧化酶氧化形成褐色的醌類化合物，醌類化合物又會(huì)在酪氨酸酶的作用下，與外植體組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，進(jìn)一步引起其他酶系統(tǒng)失活，導(dǎo)致組織代謝紊亂，生長(zhǎng)受阻，最終逐漸死亡[13-14]。研究表明，酶促褐變是由多酚氧化酶引起的。次氯酸鈉（sodium hypochlorite）是一種強(qiáng)氧化劑和消毒劑，能夠使多酚氧化酶在一定程度上失活，且具有較強(qiáng)的消毒能力，因而，常被作為易氧化褐變的外植體的滅菌劑[15-16]。

本研究以美樂葡萄的葉片為外植體，對(duì)次氯酸鈉濃度和滅菌時(shí)間進(jìn)行梯度設(shè)置，在MS 培養(yǎng)基上接種且觀察，尋找褐變率最低的組合，以期為葡萄組織培養(yǎng)提供技術(shù)支持，并為后續(xù)的試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

美樂葡萄（Vitis vinifera L. Merlot）葉片采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站。選取面積為5 cm2左右幼嫩葉片[14]進(jìn)行處理。

1.2 試驗(yàn)方法

全部采用MS 培養(yǎng)基[17]，并添加激素4 mol/L 2，4-D 和2 mol/L 6-BA 以及3%蔗糖和7.5 g/L瓊脂，pH 值為5.8。

把采好的樣品進(jìn)行預(yù)處理，即先用自來水反復(fù)沖洗約5 min，洗干凈表面的泥土污漬后，再用75%酒精浸泡30 s，之后用滅菌后的蒸餾水沖洗葉片上的酒精，最后用次氯酸鈉進(jìn)行滅菌。次氯酸鈉滅菌時(shí)間分別為30（A1），60（A2），90（A3）s，濃度（w/V）分別為1%（B1），2%（B2）和3%（B3）。

把處理好的葉片接種在培養(yǎng)基上，貼好標(biāo)簽，放入培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)（光培養(yǎng)16 h，暗培養(yǎng)8 h），5 d 后觀察感染褐變和愈傷情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種后感染及愈傷組織發(fā)生情況

從圖1 和表1 可以看出，通過自來水沖洗后用酒精進(jìn)行浸泡，不同濃度次氯酸鈉滅菌均能達(dá)到滿意的效果，各處理接種后均無污染現(xiàn)象發(fā)生。此外，次氯酸鈉各處理組中均有愈傷組織產(chǎn)生。這表明，次氯酸鈉滅菌效果能夠滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

表1 葉片接種后污染及愈傷情況

2.2 次氯酸鈉濃度對(duì)褐變率的影響

不同濃度次氯酸鈉對(duì)葡萄葉片組培褐變率的影響如圖2 所示。由圖2 可知，不同濃度次氯酸鈉滅菌后褐變率因滅菌時(shí)間不同而存在明顯差異，且當(dāng)滅菌時(shí)間不同時(shí)，不同濃度次氯酸鈉表現(xiàn)出不同的褐變率。當(dāng)處理時(shí)間較短（30 s）時(shí)，高濃度次氯酸鈉褐變率較低；而當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)后，較高濃度（2%）則表現(xiàn)較好。這表明，次氯酸鈉的滅菌效果與滅菌時(shí)間關(guān)系密切。方差分析結(jié)果表明，1%，3%，2%處理兩兩之間差異達(dá)顯著水平。

2.3 次氯酸鈉滅菌時(shí)間對(duì)褐變率的影響

次氯酸鈉滅菌時(shí)間對(duì)褐變率的影響如圖3所示。

由圖3 可知，當(dāng)次氯酸鈉濃度較低（1%）時(shí)，其褐變率隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而降低。這表明，低濃度次氯酸鈉處理在短時(shí)間（30 s）內(nèi)難以達(dá)到最佳的滅菌效果。而當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)（60 s）后，褐變率因濃度不同而表現(xiàn)不同。當(dāng)處理時(shí)間為60 s 時(shí)，2%次氯酸鈉處理褐變率最低；而當(dāng)處理時(shí)間為90 s 時(shí)，3%濃度的褐變率最低。這表明，次氯酸鈉處理時(shí)間的延長(zhǎng)和使用濃度具有互補(bǔ)性，也就是說，短時(shí)間處理應(yīng)采用高濃度，而長(zhǎng)時(shí)間處理則應(yīng)使用低濃度。方差分析結(jié)果表明，90，60 s 處理與30 s 處理之間差異達(dá)顯著水平，90 s 處理與30 s 處理之間差異達(dá)極顯著水平。

2.4 次氯酸鈉濃度和處理時(shí)間互作對(duì)褐變率的影響

當(dāng)同時(shí)考慮次氯酸鈉濃度和處理時(shí)間時(shí)，二者表現(xiàn)出明顯的互作效應(yīng)（表2）。二因素互作的情況下，褐變率較小的組合為A1B2 和A2B2，且均在0.01 水平上與其他組合差異顯著，但二者之間差異不顯著。因此，這2 個(gè)組合為次氯酸鈉對(duì)美樂葡萄葉片組培的最優(yōu)滅菌方案，即用2%的次氯酸鈉滅菌外植體葉片30～60 s。

表2 滅菌時(shí)間和藥劑濃度互作對(duì)褐變率影響的多重比較

3 討論

次氯酸鈉（sodium hypochlorite）是一種強(qiáng)氧化劑、漂白劑和消毒劑，其強(qiáng)氧化性可以使多酚氧化酶在一定程度上失活，且具有較強(qiáng)的消毒能力[15-16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，次氯酸鈉對(duì)葡萄葉片組培中褐變率存在明顯的抑制作用，且其最佳處理方法為用2%的次氯酸鈉處理30～60 s。

前人研究結(jié)果表明，褐變的主要原因是由于多酚氧化酶的存在，且多酚氧化酶的活性與多酚濃度有關(guān)[18-24]。多酚濃度較低時(shí)，隨濃度的增加多酚氧化酶活力也增強(qiáng)；而當(dāng)濃度繼續(xù)增加時(shí)，氧化反應(yīng)速度上升緩慢，且后期有下降趨勢(shì)[25]。Yu等[18]對(duì)葡萄進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，從側(cè)生枝切取的莖尖比延長(zhǎng)蔓更容易成活，進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，蔓的酚類物質(zhì)比莖尖高。有研究表明，卡特蘭在新莖旺盛生長(zhǎng)季節(jié)（6—9 月）的褐變率顯著增加，在生長(zhǎng)較弱的冬春季則顯著減少，相反，紅豆杉在旺盛的生長(zhǎng)季節(jié)的幼嫩莖段褐變少，愈傷組織的發(fā)生率高，這種季節(jié)性差異的主要因素也是由于植物體內(nèi)酚類物質(zhì)含量多少造成的[19-20]。

此外，正常組織（如葡萄葉片）雖然含有豐富的多酚類物質(zhì)但并不發(fā)生褐變，則是由于細(xì)胞內(nèi)酚類物質(zhì)和PPO 的區(qū)域性所致[21]，細(xì)胞室結(jié)構(gòu)的破壞，使底物和酶結(jié)合，這是褐變不可或缺的因素[22]。鞠志國等[23]研究發(fā)現(xiàn)，液泡是貯存酚類物質(zhì)的場(chǎng)所且不含PPO，PPO 則主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。謝春艷等[26]研究也發(fā)現(xiàn)，有活性的PPO 定位于正常細(xì)胞的質(zhì)體中，其他類型的PPO 則存在于各種囊泡中。這表明，正常情況下，細(xì)胞內(nèi)PPO和多酚類物質(zhì)的分布存在嚴(yán)格的細(xì)胞區(qū)隔。劉曼西[27]的研究同樣也證實(shí)，截?cái)喾宇愇镔|(zhì)與多酚氧化酶的接觸可以有效地防止褐變。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，次氯酸鈉低濃度（1%）時(shí)，其褐變率均較高，這可能是由于濃度較低，難以抑制多酚氧化酶活性而導(dǎo)致褐變發(fā)生嚴(yán)重。當(dāng)濃度為2%時(shí)，次氯酸鈉的濃度可以與多酚氧化酶發(fā)生反應(yīng)，阻擋了多酚氧化酶與酚類物質(zhì)的反應(yīng)，因而，其褐變率下降；當(dāng)次氯酸鈉的濃度繼續(xù)升高到3%時(shí)，不但阻擋了多酚氧化酶與酚類物質(zhì)的反應(yīng)，同時(shí)由于濃度較高，對(duì)植物細(xì)胞也造成了嚴(yán)重的影響，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因而，其褐變率再次升高。

此外，本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)滅菌時(shí)間為30 s時(shí)，1%，2%和3%的褐變率依次為84%，52%和62%；當(dāng)滅菌時(shí)間為60 s 時(shí)，其褐變率依次為73%，51%和82%，均表現(xiàn)為褐變率隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而有所降低。這可能是由于處理時(shí)間較短時(shí)，次氯酸鈉與葡萄葉片里的多酚氧化酶產(chǎn)生反應(yīng)，低濃度的次氯酸鈉（1%）由于沒有足夠的底物濃度，而無法中和掉葉片中使酚類反應(yīng)褐變的多酚氧化酶，所以，酚類物質(zhì)會(huì)在和多酚氧化酶的接觸中褐化，因而，褐化率較高；當(dāng)滅菌時(shí)間達(dá)到90 s 時(shí)，3 種濃度的次氯酸鈉幾乎對(duì)褐變率影響不大，均在70%左右。這可能是由于處理時(shí)間較長(zhǎng)（90 s），次氯酸鈉與植物細(xì)胞接觸時(shí)間過長(zhǎng)，其含量已不是褐變的決定因素，因此，無論次氯酸鈉濃度為多少，其褐變率均變化不大。

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