藜蘆活性物質(zhì)的提取及其抑菌效果研究

田慧霞，成 莉，薛文娟，高 斌，張椰莉，郭生金

（晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西晉中030600）

藜蘆（Veratrum nigrum L.）又稱山蔥，屬于百合科（Liliaceae）藜蘆屬（Veratrum L.）多年生草本植物。藜蘆屬植物約有40 余種，主要分布于亞、歐和北美洲，在我國廣泛分布于山西、河南、四川等地，生于海拔1 500～3 000 m 的山坡或山谷[1]。該屬多種植物可供藥用，然而許多品種具有毒性，有的甚至具大毒，具有抗真菌和殺死稻蝗[2]等農(nóng)業(yè)害蟲的能力。藜蘆味苦，性寒。中醫(yī)認(rèn)為，藜蘆有涌吐風(fēng)痰、殺蟲療瘡的功效，主要用于治療高血壓、中風(fēng)、瘧疾、骨折等疾病[3-4]。藜蘆全株有毒，毒素主要為藜蘆甾體生物堿[5]，藜蘆的中毒主要是急性中毒，如家畜食藜蘆后半小時(shí)至數(shù)小時(shí)后出現(xiàn)大量流涎和持續(xù)嘔吐、呻吟不安、腹脹、腹痛、腹瀉、頻頻排尿，后期為全身衰竭、抽搐，瞳孔散大，血壓和體溫下降，昏睡甚至昏迷，最后因呼吸衰竭而死。因而，其被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)方面的殺蟲、抑菌等研究[6]。

藜蘆有抗真菌的作用，其水浸劑（1∶4）在試管內(nèi)對(duì)堇色毛癬菌、同心性毛癬菌、鐵銹色小芽胞癬菌、腹股溝表皮癬菌等皮膚真菌都有不同程度的抑制作用[5]。藜蘆對(duì)結(jié)核菌也有較強(qiáng)抑制作用[7]，其乳膏有明顯的體外殺螨作用[8]，并可治療疥瘡[9]。但是，關(guān)于藜蘆中活性物質(zhì)抑菌效果的研究較少。

本試驗(yàn)就藜蘆活性物的提取及其抑菌效果進(jìn)行初步研究，通過測(cè)定藜蘆活性物質(zhì)抑制細(xì)菌的作用，為其應(yīng)用于新型植物源農(nóng)藥的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料 藜蘆（Veratrum nigrum L.）采自呂梁市龐泉溝，經(jīng)查閱《中國植物志》[10]鑒定其為黑藜蘆。

1.1.2 主要儀器和器具 脂肪提取器；250 mL圓底燒瓶；MH-500 型調(diào)溫型電熱套，北京科偉永興儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DZKW-4 型電子恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HZS-H 型水浴振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；SB-JS-1 型潔凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；GMSX-280 手提式壓力蒸汽消毒器，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；DHX-9143B 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海?，斣囼?yàn)設(shè)備有限公司；培養(yǎng)皿；牛津杯（內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm）；移液管（1 mL）；涂布棒；注射器；酒精燈。

1.1.3 使用試劑 95%乙醇水溶液，2%H2SO4溶液，石油醚，氨水，二氯甲烷（CH2Cl2）。

1.1.4 供試細(xì)菌 大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）均由山西大學(xué)生命科學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.5 試驗(yàn)所用培養(yǎng)基和無菌生理鹽水 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，自來水1 000 mL，pH 值為7.2～7.4；牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，自來水1 000 mL，pH值為7.2～7.4；無菌生理鹽水為0.85 g NaCl 溶解于蒸餾水，再經(jīng)高壓滅菌所制。

1.2 方法

1.2.1 藜蘆活性物質(zhì)的提取方法

1.2.1.1 藜蘆活性物質(zhì)的粗提取 取藜蘆根和莖，在恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，粉碎后，稱量12 g包在預(yù)先準(zhǔn)備好的濾紙包里，用200 mL 95%乙醇水溶液于100 ℃水浴中熱回流提取2.5 h。

1.2.1.2 藜蘆活性物質(zhì)的分離與純化 粗提取的藜蘆成分由SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵抽濾，去渣后，經(jīng)減壓蒸餾蒸出乙醇（0.07 MPa，40 ℃），濃縮成浸膏狀物質(zhì)。然后用2%H2SO4溶液酸化藜蘆提取物（調(diào)pH 值至3.5），用石油醚進(jìn)行脫色處理（脫色5～6 次），再用氨水調(diào)節(jié)脫色后的藜蘆提取物pH 值至9～10，用二氯甲烷萃取出藜蘆活性物質(zhì)，最后再蒸餾出二氯甲烷（101 kPa，40～50 ℃），得到純化的藜蘆活性物質(zhì)。

1.2.2 藜蘆活性物質(zhì)對(duì)3 種細(xì)菌的抑菌試驗(yàn)

1.2.2.1 藜蘆活性物質(zhì)溶液的配制 將經(jīng)二氯甲烷萃取出的藜蘆活性物質(zhì)稱質(zhì)量后，再溶解于一定量的二氯甲烷（已知二氯甲烷無抑菌作用）中，并由二氯甲烷稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.48，0.38，0.28，0.18，0.08，0.05 g/mL 的藜蘆活性物質(zhì)溶液，供抑菌試驗(yàn)用。

1.2.2.2 細(xì)菌的培養(yǎng)與接種 預(yù)先制備牛肉膏蛋白胨固體、液體培養(yǎng)基和無菌生理鹽水。先將細(xì)菌接種到已滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，放置于恒溫箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h。然后將預(yù)先融化的無菌牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿中（每皿盛12～15 mL 培養(yǎng)基），制成平板培養(yǎng)基。再將3 種細(xì)菌于無菌生理鹽水中稀釋100 倍制成菌懸液，在無菌操作條件下，用涂布法接種到平板培養(yǎng)基中，供抑菌試驗(yàn)用。

1.2.2.3 藜蘆活性物質(zhì)抑菌試驗(yàn) 取經(jīng)滅菌的牛津杯放置于已接種3 種細(xì)菌的平板培養(yǎng)基中（每皿放置4 個(gè)牛津杯），用注射器量取由二氯甲烷稀釋為不同濃度梯度的藜蘆活性物質(zhì)，并注射于牛津杯中（15 滴/ 杯），放置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃下培養(yǎng)24 h 后，觀察并測(cè)量抑菌圈大小。每種濃度的藜蘆活性物質(zhì)分別對(duì)3 種細(xì)菌各進(jìn)行3次抑菌試驗(yàn)，以蒸餾水為對(duì)照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈大小

從圖1 可以看出，藜蘆活性物質(zhì)在0.05～0.48 g/mL 范圍內(nèi)，對(duì)3 種細(xì)菌都有一定的抑制作用，而且抑菌作用隨著藜蘆活性物質(zhì)濃度的增加而增大，其中，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用比較明顯（圖1-C）。

從表1 可以看出，藜蘆活性物質(zhì)的抑菌效果與其濃度呈正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)藜蘆活性物質(zhì)的質(zhì)量濃度為0.38～0.48 g/mL 時(shí)，藜蘆活性物質(zhì)的抑菌效果良好，抑菌圈直徑在18～23 mm 之間。以蒸餾水作為對(duì)照，所做的抑菌試驗(yàn)結(jié)果如圖1-D所示。結(jié)果表明，蒸餾水對(duì)細(xì)菌沒有任何的抑制作用。

表1 藜蘆活性物質(zhì)對(duì)3種細(xì)菌的抑菌效果 mm

2.2 最小抑菌濃度

將藜蘆活性物質(zhì)稀釋成更小濃度，采用牛津杯法，對(duì)3 種細(xì)菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，測(cè)定能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的藜蘆活性物質(zhì)的最小質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，當(dāng)藜蘆活性物質(zhì)的質(zhì)量濃度小于0.08 g/mL時(shí)，對(duì)3 種細(xì)菌幾乎沒有抑制作用（圖2）。這說明能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的藜蘆活性物質(zhì)的最小質(zhì)量濃度為0.08 g/mL。

3 結(jié)論與討論

3.1 藜蘆活性物質(zhì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)最小質(zhì)量濃度

藜蘆活性物質(zhì)由二氯甲烷稀釋到0.08 g/mL時(shí)，抑菌效果不明顯；當(dāng)質(zhì)量濃度小于0.08 g/mL時(shí)，無抑菌效果，說明能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的藜蘆活性物質(zhì)的最小質(zhì)量濃度為0.08 g/mL。

3.2 藜蘆活性物質(zhì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最適濃度

藜蘆活性物質(zhì)由二氯甲烷稀釋到0.38 g/mL時(shí)，抑菌效果較好；當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.38 g/mL 時(shí)，抑菌圈大小基本無變化，說明能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的藜蘆活性物質(zhì)的最適質(zhì)量濃度為0.38 g/mL。

3.3 藜蘆活性物質(zhì)可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)

一定濃度的藜蘆活性物質(zhì)對(duì)細(xì)菌有毒殺作用，能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。

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