天然紅色素靈菌紅素的抗菌性能及應(yīng)用

王玉潔，孫詩清，朱長(zhǎng)俊，劉曉俠

嘉興學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，嘉興314001

天然色素與化學(xué)合成色素相比，具有生產(chǎn)過程友好，安全性高、無毒、色澤自然鮮艷，且有些天然色素具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健作用［1，2］。近年來，天然色素的需求每年呈遞增趨勢(shì)，而天然色素的開發(fā)生產(chǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。目前大多數(shù)天然色素來源于植物，但由于植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)且受季節(jié)、氣候、產(chǎn)地等因素的影響，提取工藝復(fù)雜，致使天然色素價(jià)格昂貴，推廣應(yīng)用受到局限［3］。開發(fā)新品種的天然色素，探索新的天然色素來源，對(duì)原有天然色素的生產(chǎn)工藝進(jìn)行改進(jìn)，擴(kuò)大天然色素的應(yīng)用范圍，降低天然色素的生產(chǎn)成本，已成為生產(chǎn)中需要迫切解決的問題。

靈菌紅素(Prodigiosins，PG)是由微生物產(chǎn)生的一類具有重要生物活性的天然色素，通常含有3 個(gè)吡咯環(huán)組成的甲氧基吡咯骨架結(jié)構(gòu)［4］。近年來發(fā)現(xiàn)靈菌紅素具有自身免疫抑制活性［5］和對(duì)肺癌、胰腺癌、前列腺癌等多種人癌細(xì)胞有抗性作用，在相同的作用劑量下，對(duì)正常細(xì)胞無任何毒害作用［6-7］，已成為一種極具發(fā)展?jié)摿Φ目拱┖蜻x藥物。另外靈菌紅素在極低的濃度下，能快速殺死導(dǎo)致赤潮的浮游生物［8］，在水體污染的治理方面顯示出巨大的威力。初步研究表明，天然色素靈菌紅素在羊毛、變性聚丙烯腈纖維等織物上具有良好的上染率和抗菌性能［9-12］。最新的研究表明靈菌紅素還可作為紫外線的保護(hù)劑［13］。

本文考察了發(fā)酵生產(chǎn)紅色素的抗菌性，并以此作為環(huán)保染料，考察其對(duì)天然纖維真絲和棉的染色性能及其抗菌性，為其作為抗菌生態(tài)染料應(yīng)用開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

粘質(zhì)沙雷氏菌jx1(Serratia marcescens jx1)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)，大腸桿菌(Escherichia coli)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，由實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂18，pH 7.4～7.6。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨13. 0，甘油20. 0，MgSO41.2，NaCl 5.0，搖瓶裝液量20 mL/100 mL(V/V)，接種量5%(V/V)，pH 6.5。

1.3 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng):菌株經(jīng)斜面活化后，接入種子培養(yǎng)基中，37 ℃、180 rrpm 的搖床培養(yǎng)12 h。

發(fā)酵培養(yǎng):250 mL 三角瓶，裝液量50 mL，按5%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 rpm搖床上培養(yǎng)48 h。

1.4 紅色素的提取

量取上述發(fā)酵液10 mL，離心10，000 rmp，10 min，取沉淀加丙酮20 mL 充分混和提取10 min，10 000 rmp 離心10 min，取上清液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至恒重，再溶于乙酸乙酯，經(jīng)濾紙過濾后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至恒重，得紅色素樣品。

1.5 紅色素染色

取干燥研磨后的靈菌紅素0.1 g 溶于25 mL 乙醇中，溶解后用蒸餾水定容至50 mL。將50 mL 初染料加入錐形瓶中，同時(shí)加入50 mL 水以及1 mL 冰醋，搖勻即制得染料。染料用量為1%(o. w. f)，浴比1∶30，pH 值為4.0～6.0，染色溫度為100 ℃，染色時(shí)間為1 h。

1.6 紅色素抑菌性能測(cè)試

1.6.1 不同濃度紅色素靈菌紅素的抑菌性能測(cè)定

取待測(cè)菌懸液0.1 mL(106-107CFU /mL)，用涂布棒將菌液涂布均勻。分別吸取10 μL 濃度為4、2 和1 mg/mL 的靈菌紅素溶液于無菌干燥濾紙片(直徑5 mm)，貼在含菌平板上，用乙醇作對(duì)照，每種菌做三個(gè)重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，采用十字交叉法測(cè)定含藥濾紙片的抑菌圈直徑大小，取平均值，比較抑菌效果。

1.6.2 靈菌紅素的最小抑菌濃度測(cè)定

液體倍數(shù)稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度(Mininum Inhibitory Concentration MIC)測(cè)定方法在文獻(xiàn)［14］基礎(chǔ)上稍作修改。液體培養(yǎng)基按每管3 mL 分裝試管，再加入不同量的靈菌紅素溶液，配成一系列濃度梯度的培養(yǎng)基。每支試管培養(yǎng)基接種0.15 mL 的待測(cè)菌液，于37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，另取加入與靈菌紅素等量的二甲基亞砜(DMSO)及無菌水作為對(duì)照。以肉眼觀察培養(yǎng)基澄清，無細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)的最低濃度為MIC。

1.6.3 靈菌紅素的最小殺菌濃度測(cè)定

從各試驗(yàn)的MIC 和高于MIC 的試管中吸取0.15 mL 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌體的生長(zhǎng)情況，無菌落生長(zhǎng)(澄清試管)的最小濃度即為該藥液對(duì)該菌的最小殺菌濃度(MBC)。

1.7 上染率測(cè)試

通過測(cè)靈菌紅素的最大吸收波長(zhǎng)535 nm 處的吸光度來計(jì)算上染率。上染率的測(cè)試公式:

上染百分率 = (1-Ei/E0)× 100%

式中:Ei— 染液殘液吸光度;E0— 原染液吸光度

1.8 靈菌紅素染色織物的抗菌性測(cè)定

1.8.1 平板抑菌圈法

參照GB/T 20944.1-2008 國(guó)標(biāo)法。將待測(cè)菌株活化，配制成合適密度的菌懸液(1 ×108CFU/mL～5 ×108CFU/mL)，取0.1 mL 進(jìn)行涂布平板，然后將原始織物和染色織物分別剪碎，緊密堆于涂布了待測(cè)菌種的平板中間，直徑約為2 cm，于37 ℃下培養(yǎng)24 h，測(cè)量其抑菌圈直徑。

1.8.2 震蕩法

參照GB/T 20944.3-2008 國(guó)標(biāo)法。將待測(cè)菌株活化，挑取至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中配制成合適濃度的菌懸液，稱取原始織物和染色織物各0.75 g，剪成0.5 cm 方塊，用紙包包好，合適條件滅菌，分別裝入70 mL 已滅菌的PBS 三角燒瓶，200 rpm，37℃，培養(yǎng)24 h，分別取培養(yǎng)液作梯度稀釋，取0.1 mL合適稀釋濃度的菌液涂布平板，選取合適的菌落數(shù)計(jì)數(shù)，計(jì)算抑菌率。

抑菌率(%)=〔(A 一B)/A〕× 100%

式中:A 為對(duì)照布樣平均菌落數(shù);B 為抗菌布樣平均菌落數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度紅色素靈菌紅素的抑菌性能測(cè)定

通過平板抑菌圈法定性測(cè)定靈菌紅素的抑菌性，結(jié)果如圖1 所示。

表1 不同濃度靈菌紅素對(duì)細(xì)菌的抑菌圈大小比較Table 1 Inhibition zone of different concentration of prodigiosin

靈菌紅素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌都有一定的抑制作用，且抑菌效果隨著濃度的增加而增強(qiáng)。在這三種待試菌種中，靈菌紅素對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制能力最強(qiáng)，金黃色葡萄球菌次之，而對(duì)大腸桿菌的抑制能力最弱。

2.2 靈菌紅素最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測(cè)定

通過測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)來量化靈菌紅素的抑菌性能。將在測(cè)定抑菌實(shí)驗(yàn)中，未長(zhǎng)菌的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行轉(zhuǎn)接，獲最小殺菌濃度，結(jié)果如表2-表7 所示。

表2 大腸桿菌MIC 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of MIC on E.coli

表3 大腸桿菌MBC 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of MBC on E.coli

表4 枯草芽孢桿菌MIC 測(cè)定Table 4 Results of MIC on B.subtilis

表5 枯草芽孢桿菌MBC 測(cè)定Table 5 Results of MBC on B.subtilis

表6 金黃色葡萄球菌MIC 測(cè)定Table 6 Results of MIC on S.aureus

表7 金黃色葡萄球菌MBC 測(cè)定Table 7 Results of MBC on S.aureus

由表2-表7 可知，靈菌紅素對(duì)大腸桿菌最小抑菌濃度MIC 為0. 05 g/L 培養(yǎng)基，最小殺菌濃度MBC 為0.8 g/L 培養(yǎng)基;對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC 為0.007 g/L 培養(yǎng)基，MBC 為0.013 g/L 培養(yǎng)基，對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度MIC 為0.002 g/L 培養(yǎng)基，最小殺菌濃度MBC 為0.005 g/L 培養(yǎng)基。靈菌紅素對(duì)革蘭氏陽性菌的抑菌效果要優(yōu)于革蘭氏陰性菌，這與Mekhael 等［13］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，其抑菌機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

2.3 不同天然織物的上染率

在同樣的染色條件下，測(cè)的靈菌紅素染料對(duì)棉織物和真絲的上染率，見圖1。

從圖1 中可以看出，靈菌紅素對(duì)真絲的親和力要高于棉織物，可能的原因與天然纖維的結(jié)構(gòu)有關(guān)。絲纖維是由若干直徑10 毫微米左右的絲朊散纖維構(gòu)成，內(nèi)部存在小孔隙，在熱脹冷縮的條件下，染料分子進(jìn)入孔隙，較難析出。而棉纖維為較大的多孔性結(jié)構(gòu)，較易析出，表現(xiàn)出親和力較低。

圖1 不同織物的上染率Fig.1 Dye-uptake of different fabrics

2.4 靈菌紅素對(duì)天然纖維的染色性能及抗菌性

采用靈菌紅素制備成染料，分別對(duì)真絲和棉織物進(jìn)行初步染色并對(duì)其抗菌性能進(jìn)行測(cè)試。首先測(cè)定真絲染色后的平板抑菌圈見圖2。

實(shí)驗(yàn)測(cè)得染色后的纖維對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌直徑為1.1 cm，而對(duì)照僅為0.27 cm，對(duì)染色后的纖維大腸桿菌的抑菌直徑為0.125 cm，對(duì)照抑菌直徑為0.05 cm，根據(jù)GB/T20944-2008 中的瓊脂平皿擴(kuò)散法的抗菌效果評(píng)價(jià)，可以看出抑菌圈直徑在0～1 mm 之間，織物下無細(xì)菌繁殖，評(píng)價(jià)為效果好。根據(jù)棉織物染色后平板抑菌圈(圖未顯示)明顯，抑菌效果好。并進(jìn)一步采用振蕩法測(cè)定其抑菌率，染色后真絲對(duì)大腸桿菌的抑菌率為95.2%，而對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率為90.1%。鐘綿國(guó)等利用靈菌紅素對(duì)羊毛、腈綸等織物染色后對(duì)大腸桿菌抑菌率達(dá)也均達(dá)到80%以上［9］，而Alihosseini 等對(duì)染色后絲的抗菌性進(jìn)行測(cè)試，對(duì)大腸桿菌的抑菌率為35%，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率為29%，而染色后棉織物未表現(xiàn)出抗菌性［11］，有些染色后不同織物和不同染色方法所染的相同織物抑菌率存在顯著差異，可能的原因，一方面和染色方法及織物中所含的靈菌紅素量有關(guān)，另一方面這可能和織物的纖維結(jié)構(gòu)以及染料對(duì)其親和力有關(guān)，具體原因尚有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

3.1 靈菌紅素對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有良好抗性，對(duì)革蘭氏陽性菌要優(yōu)于革蘭氏陰性菌。

3.2 靈菌紅素作為染料，對(duì)真絲的親和力要大于棉織物。

3.3 經(jīng)靈菌紅素染色后天然纖維，對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均表現(xiàn)出良好的抗菌性，但對(duì)革蘭氏陰性菌的抗性要優(yōu)于革蘭氏陽性菌，這和游離的靈菌紅素的抗菌性不同，具體原因尚需進(jìn)一步研究。

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