“一測多評”法測定卷葉貝母中生物堿類成分含量

徐 彥，劉 圓，呂露陽，張志鋒

西南民族大學(xué)少數(shù)民族藥物研究所，成都 610041

貝母，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列入中品，具有清熱潤肺、化痰止咳的功效，有“止咳圣藥”之稱，在我國應(yīng)用與研究已有兩千余年的歷史。我國大約有60 種45 變種5 變型［1］，《中國藥典》2010 版記載川貝母包括6 個基源，其中卷葉貝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)，為常用川貝母的來源之一。近年來，有關(guān)川貝母質(zhì)量評價研究日益增多，包括分類學(xué)鑒定、化學(xué)成分含量測定以及藥效學(xué)的研究等［2-5］。然而，采用“一測多評”法(Quantitative Analysis of Multicomponents by Single marker，QAMS)，測定川貝母中的貝母乙素和貝母甲素還未見文獻報道。

“一測多評”法是一種用于多成分質(zhì)量控制的研究方法，目前已用于中藥質(zhì)量控制的研究，尤其對中藥缺乏對照品的研究具有重要的意義［6］，該法也被2010 年版《中國藥典》采納。本研究應(yīng)用“一測多評”法對卷葉貝母進行多指標質(zhì)量控制研究，即以貝母乙素對照品為內(nèi)標物，通過建立其與貝母甲素的相對校正因子(Relative correction factor，RCF)進行含量計算，以降低檢測成本和時間，驗證方法的實用性，為川貝母中其他生物堿的檢測及其它基源川貝母類藥材的質(zhì)量控制研究提供參考。

1 儀器、試劑和材料

Agilent 1200 高效液相色譜儀(Agilent，美國)，Waters2695 高效液相色譜儀(Waters，美國)，包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD 檢測器、工作站;Alltech-2000 ELSD 蒸發(fā)光散射檢測器(Alltech，美國);Millipore Milli-Q 超純水機(Millipore，美國);METTLER AE240 電子分析天平(梅特勒-托利多，德國);W201B 恒溫水浴鍋(上海申順生物科技有限公司)。乙腈、甲醇(色譜純，Merck 公司)，乙醇等其他試劑均為分析純。貝母乙素(Peiminine，批號:110751-200709)、貝母甲素(Peimine，批號:110750-200609)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所(純度＞98%)。本研究藥材為卷葉貝母(F.cirrhosa)的鱗莖，采集于四川省康定縣境內(nèi)，經(jīng)西南民族大學(xué)劉圓教授鑒定為卷葉貝母。

2 方法與結(jié)果

本研究首先對HPLC-ELSD 同時測定卷葉貝母中的貝母甲素和貝母乙素和進行了方法學(xué)考察，然后對一測多評法的耐用性和適用性進行了評價，最后對所收集的樣品進行測定并比較外標法和一測多評法測定結(jié)果的差異。

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 HPLC-ELSD 系統(tǒng)適應(yīng)性條件

以乙腈(A)– 0.08%三乙胺水溶液(B)為流動相，梯度洗脫(0～13 min，20% A→30% A;13～20 min，30% A;20～55 min，30% A→60% A;55～65 min，60% A;65～70 min，60% A→95% A;流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，ELSD 檢測:溫度88 ℃，N2流速2.2 L/min。

2.1.2 對照品溶液的制備

分別取貝母甲素和貝母乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL 各含0.5 mg 和0.5 mg 的貯備溶液。臨用前稀釋，制成混合對照品溶液(貝母甲素0.15 mg/mL，貝母乙素0.2 mg/mL)。

2.1.3 供試品溶液的制備

稱取5 g 卷葉貝母藥材粉末(過40 目篩)，置圓底燒餅中，先用8 mL 氨水浸潤1 h，然后加入100 mL 氯仿-甲醇(4∶1)混合溶劑，70 ℃水浴上加熱4 h，濾渣用50 mL 混合溶劑洗滌，過濾，合并濾液，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中水浴蒸干，用甲醇溶解，定容至5 mL，搖勻即得母液(生藥量1 g/mL)。在進行樣品測定時，取母液2 mL 定容于10 mL，得濃度為0.2 g/mL溶液作為供試液。

2.1.4 線性關(guān)系的考察

分別吸取不同體積的貝母甲素和貝母乙素貯備溶液，甲醇溶解并稀釋制成含貝母乙素和貝母甲素的5 個不同質(zhì)量濃度的系列溶液。按上述色譜條件測定，以對照品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標，峰面積積分值(Y)為縱坐標，進行回歸處理，得貝母乙素的回歸方程分別為y =1. 7387x + 5. 026 (r =0.9992)，線性范圍0.4～6 μg;貝母甲素的回歸方程分別為y =1.6949x + 4.8321 (r =0.9991)，線性范圍0.3～4.5 μg。

2.1.5 精密度試驗

取同一對照品溶液，按照上述色譜條件連續(xù)進樣6 次，根據(jù)貝母甲素和貝母乙素的色譜峰面積，計算其RSD 分別為1.7%和0.1%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗

取同一批次卷葉貝母樣品粉末6 份，精密稱定，按2.3 項下操作，在上述色譜條件下進樣測定，測得貝母甲素和貝母乙素的平均質(zhì)量分數(shù)分別為0.03%，0.03%，RSD 分別為1.2%和0.8%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗

取同一批次的卷葉貝母樣品粉末精密稱定，按2.3 項下操作，分別于0、2、4、6、8、12 h 進樣分析，測得貝母乙素、貝母甲素色譜峰面積的RSD 分別為0.7%和0.4%，結(jié)果表明樣品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗

取已知質(zhì)量分數(shù)的卷葉貝母樣品粉末6 份，各約2.5 g，精密稱定，分別按已知質(zhì)量分數(shù)的80%、100%和120% 3 個水平加入貝母甲素和貝母乙素對照品，按2.3 項下操作，在上述色譜條件下進樣測定，計算加樣回收率，貝母乙素、貝母甲素的加樣回收率分別為99.8%、97.2%，RSD 分別為1.1%和2.8%。

2.2 “一測多評”耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性評價

2.2.1 色譜柱考察

取“2.1.4”項下制備的混合對照品溶液，進樣20 μL，以貝母乙素為內(nèi)標，計算貝母乙素對貝母甲素的相對校正因子，考察了Dikma Spursil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Agilent Extend C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent Grace C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)等3 種色譜柱對相對校正因子的影響，結(jié)果見表1。表明不同色譜柱所得到的校正因子基本一致。

2.2.2 校正因子重現(xiàn)性考察

取“2.1.4”項下制備的混合對照品溶液，進樣20 μL，以貝母乙素為內(nèi)標，計算貝母乙素對貝母甲素的相對校正因子RCF，RCF = fs/fi= (As/Cs)/(Ai/Ci)，其中As為內(nèi)標s 峰面積，Cs為內(nèi)標s 濃度，Ai為某待測成分對照品i 峰面積，Ci為某待測成分對照品i 濃度。本研究考察了Waters 2695 和Agilent 1200 兩種高效液相色譜儀對相對校正因子的影響，結(jié)果見表1，表明在不同的液相色譜系統(tǒng)下所得到的相對校正因子基本一致。

2.2.3 待測色譜峰的定位

采用貝母甲素與貝母乙素內(nèi)標的相對保留值(Relative retention time，RRT)作為色譜峰定位標準，RRT=Ts/Ti，Ts為內(nèi)標s 保留時間，Ti為某待測成分i 保留時間。并考察了其在不同儀器和不同色譜柱上的重復(fù)性，結(jié)果表明相對保留值波動較小，RSD 2.8%，因而本研究選用相對保留值作為目標色譜峰的定位指標。并且在此色譜條件下各批貝母樣品的色譜峰峰形較好，分離度高，因此在“一測多評”法的實際應(yīng)用中，可參考藥材典型色譜圖，利用相對保留值定位，根據(jù)內(nèi)標貝母乙素的保留時間，通過相對保留值，因而能夠正確判斷目標峰的準確峰位置。

2.3 樣品測定

取4 批卷葉貝母樣品粉末約0.2 g，精密稱定，按2.1.3 項下制備供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液進樣測定。分別采用外標法和一測多評法計算卷葉貝母中貝母甲素和貝母乙素的含量，結(jié)果見表2，圖1。結(jié)果兩種方法所得含量無顯著性差異，由此說明“一測多評”法可用于卷葉貝母的多種生物堿類成分質(zhì)量研究。

表1 貝母甲素的相對校正因子和保留值(n = 6)Table 1 Related correction factors and related retention time of Peimine (n = 6)

表2 外標法和QAMS 測定卷葉貝母中貝母甲素和貝母乙素的含量(n=3)Table 2 The results of Peiminine and Peimine in F.cirrhosa by external standard method and QAMS

圖1 混合對照品(A)和川貝母樣品(B)的HPLC-ELSDFig.1 HPLC-ELSD chromatograms of mixed markers (A)and F.cirrhosa sample (B)

3 討論

“一測多評”法是指在一定的線性范圍，某一類化學(xué)成分的量(質(zhì)量或濃度)與檢測器響應(yīng)成正比。在多指標(s，a，b，…，i，…)質(zhì)量評價時，以藥材(或成藥)中某一典型有效成分作內(nèi)標(s)，建立內(nèi)標與其它待測成分(a，b，…，i，…)間的相對校正因子(RCF)進行計算的質(zhì)量評價模式，該方法實現(xiàn)多成分質(zhì)量控制，同時又能克服中藥對照品較少，不易獲得和檢測成本高等困難，是傳統(tǒng)指紋圖譜對藥材進行質(zhì)量評價基礎(chǔ)上的又一個里程碑。

川貝母，由于大多來自野生資源，其價格日益高漲，在市場上魚目混珠的現(xiàn)象非常嚴重，因此，對川貝母的資源進行質(zhì)量評價，一直是眾多科研工作者致力于解決的問題。本研究以實地采集的川貝母中的卷葉貝母作為研究對象，意在正本清源，為其他基源的川貝母的含量測定提供一種可行的思路。

本研究選用了對不同的流動相以及流動相的比例進行了分析，考察了乙腈(A)-0.02%磷酸鹽水溶液(B)為流動相、甲醇(A)-0. 02% 磷酸鹽水溶液(B)等，最終乙腈(A)-0.08%三乙胺水溶液(B)為流動相，分離度高，峰形好?？疾炝瞬煌放频纳V柱以及色譜系統(tǒng)對貝母甲素的相對校正因子的影響，結(jié)果實驗得到的校正因子具有較高的可信度，系統(tǒng)差異較小，通過計算結(jié)果表明，采用一測多評法計算的貝母甲素的結(jié)果和外標法測得的結(jié)果沒有顯著性差異。表明一測多評法可以在對照品缺失的情況下，實現(xiàn)定量測定的要求，為貝母類藥材的質(zhì)量評價以及《中國藥典》的修訂提供依據(jù)。

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