MDR1 基因沉默增強(qiáng)三尖杉酯堿誘導(dǎo)的HT9 細(xì)胞凋亡*

張偉偉， 邵淑麗， 張珍珠， 付 博

(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾161006)

三尖杉酯堿(harringtonine，HT)是從海南粗榧屬植物中提取的抗腫瘤藥物，具有細(xì)胞毒、DNA 合成抑制及染色體損傷等作用［1－2］，能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞HL60 凋亡［3－7］。但在治療中，白血病和腫瘤細(xì)胞的藥物不敏感性或耐藥性的產(chǎn)生，往往導(dǎo)致治療的失敗。腫瘤多藥耐藥產(chǎn)生的機(jī)制較為復(fù)雜，包括ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員的過表達(dá)［8］、拓?fù)洚悩?gòu)酶II活性的改變、谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶的修飾［9］、細(xì)胞凋亡抑制基因bcl－2［10］的過表達(dá)及p53 基因的突變等。其中，ATP 結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)基因的過表達(dá)成為經(jīng)典的多藥耐藥表型［11］，在近50%的人類癌癥中存在高表達(dá)。P－糖蛋白(P－glycoprotein)又稱多藥耐藥蛋白1(multidrug resistance protein 1，MDR1)可以利用ATP 水解釋放的能量將化療藥物泵出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度始終維持在低水平，減弱藥物的細(xì)胞毒作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞對結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的多種藥物產(chǎn)生耐藥性。本實(shí)驗(yàn)利用RNA 干擾的方法，設(shè)計(jì)1 條靶向MDR1 的shRNA，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HT9 細(xì)胞后，檢測HT9 細(xì)胞對三尖杉酯堿的敏感性，探討靶向MDR1 基因的shRNA 對三尖杉酯堿誘導(dǎo)的HT9細(xì)胞凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

質(zhì)粒pSilencer 3.1－H1 neo 購自北京鼎國生物公司，敏感的和耐三尖杉酯堿的人白血病細(xì)胞株HL60 和HT9 來源于北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，RPMI－1640培養(yǎng)基、胎牛血清(上海生工);C219 抗體(Signet)，β－actin 抗體(Signet)，IgG (Jakson ImmunoResearch Lab)，ECM830 型電穿孔儀(BTX);熒光定量PCR 儀(ABI PRISM 7700);流式細(xì)胞儀FC500(貝克曼)，激光共聚焦顯微鏡 (Olympus FV500)。

2 方法

2.1 MDR1 shRNA 表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank MDR1 mRNA 的已知序列(NM_000927)，選擇shRNA 特異性靶位點(diǎn)序列。設(shè)計(jì)合成MDR1 shRNA 的DNA 模板，將其定向克隆到pSilencer 3.1－H1 neo 載體上，shRNA 表達(dá)質(zhì)粒命名為pSilencer 3. 1－MDR1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，測序鑒定。以含隨機(jī)序列的pSilencer 3.1－H1 neo 質(zhì)粒為陰性對照。

2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 細(xì)胞均用含10%胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的RPMI－1640 培養(yǎng)液于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HT9 細(xì)胞，通過pEGFP－N1質(zhì)粒優(yōu)化電轉(zhuǎn)染條件，線性化的重組質(zhì)粒于最佳電轉(zhuǎn)染條件下電轉(zhuǎn)染HT9 細(xì)胞，用600 mg/L G418 篩選建立穩(wěn)定表達(dá)siRNA 的HT9 細(xì)胞克隆。有限稀釋法挑取單克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別得到HT9/sh－3. 1(轉(zhuǎn)染pSilencer 3.1－H1 neo)和HT9/sh－3. 1－1(轉(zhuǎn)染pSilencer 3.1－MDR1)。

2.3 實(shí)時熒光定量PCR 檢測MDR1 mRNA 采用UNIQ－10 柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒(Sangon)提取細(xì)胞總RNA。MDR1 正義鏈ATATCAGCAGCCCACATCAT，反義鏈GAAGCACTGGGATGTCCGGT，擴(kuò)增產(chǎn)物為154 bp。以β－actin 為內(nèi)參照，β－actin正義鏈 ATCATGTTTGAGACCTTCAACA，反義鏈CATCTCTTGCTCGAAGTCCA，擴(kuò)增產(chǎn)物為318 bp。實(shí)時熒光定量PCR 擴(kuò)增條件:94 ℃3 min，94 ℃1 min，58 ℃1 min，72 ℃1 min，循環(huán)35 次，72 ℃檢測信號，循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以2－ΔΔCt)進(jìn)行計(jì)算。

2.4 Western blotting 檢測MDR1 蛋白的表達(dá) 收集未轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HT9 細(xì)胞，提取總蛋白，樣品進(jìn)行SDS－PAGE 凝膠電泳，用Bio－Rad 電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜條件為150 V 恒壓3 h，5%脫脂奶粉封閉1h，加C219 Ⅰ抗(1∶100)，內(nèi)參照β－actinⅠ抗4 ℃孵育過夜，PBS 洗膜，加Ⅱ抗IgG(1∶10 000)，室溫孵育2 h，ECL 發(fā)光液發(fā)光成像，用凝膠圖像分析軟件分析灰度值。

2.5 MTT 法檢測耐藥逆轉(zhuǎn)效果 細(xì)胞中分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/L 三尖杉酯堿，常規(guī)MTT 法檢測，測得實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的存活率，570 nm 下測吸光度(A)。細(xì)胞存活率(%)=A(實(shí)驗(yàn)組)/A(對照組)×100%，以藥物濃度為橫軸，細(xì)胞存活率為縱軸繪制濃度效應(yīng)曲線，求出回歸方程，確定半數(shù)抑制濃度(IC50)并計(jì)算相對逆轉(zhuǎn)率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.6 DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞中加入1.0 mg/L 三尖杉酯堿作用24 h 后，按照凋亡細(xì)胞DNA 提取試劑盒(上海生工)說明書提取各組細(xì)胞DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 片段化。

2.7 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)

細(xì)胞中分別加入1.0 mg/L 三尖杉酯堿作用24 h后，800 r/min 離心10 min 收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS 洗3次，0.5 g/L 吖啶橙(acridine orange，AO)37 ℃孵育10 min。激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)染色體形態(tài)。

2.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 細(xì)胞中分別加入終濃度為1.0 mg/L 三尖杉酯堿作用24 h 后，800 r/min 離心10 min 收集細(xì)胞，加入1 mL－20 ℃預(yù)冷的70%乙醇，充分混勻，4 ℃保存，固定至少18 h，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×109/L，取1 mL 細(xì)胞懸液，用PBS 洗3 次，細(xì)胞重懸于1 mL 含20 mg/L RNase A 和50 mg/L PI 的染液中，37 ℃孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(汞激發(fā)波長為488 nm)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，進(jìn)行單因素方差分析(One－way ANOVA)，組間比較用LSD 法檢測其差異性，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MDR1 shRNA 表達(dá)載體的鑒定

經(jīng)測序結(jié)果鑒定，重組質(zhì)粒的堿基序列與預(yù)期結(jié)果一致，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖1。

Figure 1. The analysis of target sequence in the recombinant plasmid.圖1 重組質(zhì)粒pSilencer 3.1－MDR1 中shRNA 的序列分析

2 pEGFP－N1 質(zhì)粒優(yōu)化電轉(zhuǎn)染條件

電轉(zhuǎn)染時間定為30 ms，分別調(diào)節(jié)電壓為240 V、250 V、260 V、270 V、280 V 和290 V 進(jìn)行電轉(zhuǎn)染條件的摸索。結(jié)果顯示，電壓為280 V 時，細(xì)胞存活率在40% ～50%之間，有約70%的細(xì)胞發(fā)綠色熒光，見圖2，因此，確定脈沖時間30 ms、電壓280 V 為電轉(zhuǎn)染HT9 細(xì)胞的最佳條件。

Figure 2. The expression of green fluorescent protein in HT9 cells (× 200). A:under phase－contrast microscope;B:under fluorescence microscope.圖2 綠色熒光蛋白在HT9 細(xì)胞中表達(dá)

3 熒光定量PCR 檢測MDR－1 mRNA 的表達(dá)

應(yīng)用定量PCR 儀自帶數(shù)據(jù)分析軟件獲得Ct 計(jì)算出各組細(xì)胞MDR－1 mRNA 表達(dá)值，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MDR1/β－actin 的值。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pSilencer 3.1－MDR1 可以顯著降低HT9 細(xì)胞MDR1 mRNA 的表達(dá)，單克隆細(xì)胞HT9/sh－3. 1－1 的MDR1/β－actin mRNA 比值明顯降低，與HT9 細(xì)胞相比單克隆細(xì)胞HT9/sh－3.1－1 MDR1 mRNA 的表達(dá)降低了75.4%(P ＜0.01)，見圖3。

4 Western blotting 檢測MDR1 蛋白的表達(dá)

重組質(zhì)粒pSilencer 3.1－MDR1 可以顯著降低HT9 細(xì)胞DMR1 蛋白的表達(dá)，單克隆細(xì)胞HT9/sh－3. 1－1的MDR1/β－actin比值明顯降低，與HT9細(xì)胞相比單克隆細(xì)胞HT9/sh－3.1－1 MDR1 蛋白的表達(dá)降低了41.13%(P ＜0.05)，見圖4。

Figure 3. The expression level of MDR1 mRNA in different cells.±s.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs HT9;△P ＜0.05 vs HT9/sh－3.1－1.圖3 各組細(xì)胞中MDR1 mRNA 的表達(dá)水平

5 多藥耐藥逆轉(zhuǎn)效果

MTT 檢測顯示，與HT9 細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)陽性單克隆細(xì)胞HT9/sh－3.1－1 抗腫瘤藥的IC50顯著降低(P ＜0.01)，見表1。

6 三尖杉酯堿作用后各組細(xì)胞的DNA 片段化

提取細(xì)胞基因組DNA，進(jìn)行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，凋亡細(xì)胞的DNA 顯示出180 ～200 bp 及其不同倍數(shù)的梯帶，這被視為最典型的凋亡指標(biāo)。DNA凝膠電泳結(jié)果顯示，與HT9 細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)陽性單克隆細(xì)胞HT9/sh－3.1－1 的DNA ladder 更明顯，細(xì)胞染色質(zhì)DNA 裂解成180 ～200 bp 大小不等的片段，而HT9/sh－3.1 細(xì)胞則沒有出現(xiàn)凋亡細(xì)胞特有的梯帶，見圖5。

7 三尖杉酯堿對各組細(xì)胞形態(tài)的影響

Figure 4. The expression level of MDR1 protein in different cells. ±s.n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs HT9;△P ＜0.05 vs HT9/sh－3.1－1.圖4 各組細(xì)胞中MDR1 蛋白的表達(dá)水平

表1 三尖杉酯堿作用24 h 后各組細(xì)胞的IC50Table 1. The IC50 of harringtonine for different cells (±s.n=3)

表1 三尖杉酯堿作用24 h 后各組細(xì)胞的IC50Table 1. The IC50 of harringtonine for different cells (±s.n=3)

＊＊P ＜0.01 vs HT9.

Group IC50(mg/L) Reversal fold Reversal rate(%)HT9 1.184±0. 130 104.78±6.57—HT9/sh－3.1 1.128±0. 160 99.78±7.41 4.817±1.390 HT9/sh－3.1－1 0.711±0.010＊＊ 62.91±2.96＊＊ 40.350±2.810 HL60 0.011±0.019＊＊—

Figure 5. Comparison of DNA ladder in different cells.M:DNA marker;1:HT9 cells;2:HT9/sh－3. 1 cells;3:HT9/sh－3.1－1 cells;4:HL60 cells.圖5 各組細(xì)胞DNA ladder 的比較

各組細(xì)胞經(jīng)三尖杉酯堿處理，用吖啶橙染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，如圖6 所示，HL60 細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的凋亡特征，染色質(zhì)高度凝集和邊緣化，細(xì)胞質(zhì)出泡，出現(xiàn)凋亡小體，見圖6A;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HT9/sh－3.1－1 細(xì)胞胞核呈現(xiàn)大小不等、形態(tài)不規(guī)則的碎片狀或梅花狀，為典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)，見圖6D，HT9 細(xì)胞和HT9/sh－3.1 細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)。

8 三尖杉酯堿對細(xì)胞周期的阻滯作用

HT9、HT9/sh－3.1、HT9/sh－3. 1－1 和HL60細(xì)胞經(jīng)三尖杉酯堿誘導(dǎo)24 h 后收集，流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果表明，與HT9 細(xì)胞相比，HT9/sh－3.1 細(xì)胞的細(xì)胞周期未發(fā)現(xiàn)顯著變化，HT9/sh－3.1－1 細(xì)胞的S 期細(xì)胞增多，并出現(xiàn)明顯的凋亡亞峰，見圖7。

討 論

白血病是最常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤之一，目前聯(lián)合化療仍然是白血病治療的重要措施，而白血病細(xì)胞多藥耐藥的產(chǎn)生則使部分白血病的化療最終歸于失敗。隨著耐藥機(jī)制研究的一步步深入，各種耐藥逆轉(zhuǎn)劑等也不斷涌現(xiàn)，主要包括基因治療［12］、免疫療法［13］和藥物治療。其中RNA 干擾是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)特異性抑制基因表達(dá)的基因治療方法。RNA 干擾最主要的功能是調(diào)節(jié)和關(guān)閉特定基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各種高級生命活動。這一特異、有效的基因沉默技術(shù)現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于白血病多藥耐藥等方面的研究。張敏等［14］研究了靶向mdr1 4個不同位點(diǎn)的siRNA 對耐藥細(xì)胞MDR 的逆轉(zhuǎn)效果，結(jié)果顯示4 條siRNA 轉(zhuǎn)染72 h 后K562/A02 細(xì)胞對ADR 的敏感性增強(qiáng)，相對逆轉(zhuǎn)率依次為90.61%、54.27%、96. 39% 和85. 32%。邵淑麗等［15］針 對MRP1 基因構(gòu)建了2 個shRNA 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞株A549/DDP 后MRP1 mRNA 和MRP1 蛋白表達(dá)均顯著降低，細(xì)胞內(nèi)Rho123 相對熒光強(qiáng)度明顯提高;轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對DDP 的IC50和對5－FU 的IC50均顯著降低，有效逆轉(zhuǎn)了A549/DDP的多藥耐藥。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了shRNA 表達(dá)載體pSilencer 3. 1－MDR1，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，經(jīng)熒光定量PCR 和Western blotting 檢測，與HT9 細(xì)胞相比單克隆細(xì)胞HT9/sh－3.1－1 MDR1 mRNA 的表達(dá)降低了75.4%(P ＜0.01)，MDR1 蛋白的表達(dá)降低了41.13%(P ＜0.05)。夏忠勝等［16］在結(jié)腸癌細(xì)胞的研究中得到相似結(jié)果。眾所周知，MDR1 能將化療藥物泵出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度始終維持在低水平，減弱藥物的細(xì)胞毒作 用。經(jīng) 載 體p Silencer3. 1－H1 neo－MDR1 轉(zhuǎn) 染后，單克隆細(xì)胞HT9/sh－3.1－1 中MDR1 的表達(dá)顯著降低，三尖杉酯堿的IC50亦顯著降低，相對逆轉(zhuǎn)率為40.35%。這為后續(xù)細(xì)胞凋亡研究打下基礎(chǔ)。

Figure 6. Morphology of the chromatin in the cells treated with harringtonine under laser confocal microscope(acridine orange staining，×400).A:HL60 cells;B:HT9 cells;C:HT9/sh－3.1 cells;D:HT9/sh－3.1－1 cells.圖6 激光共聚焦下各組細(xì)胞染色質(zhì)的形態(tài)

Figure 7. Apoptosis of the cells treated with harringtonine detected by flow cytometry. A:HL60 cells;B:HT9 cells;C:HT9/sh－3.1－1 cells;D:HT9/sh－3.1 cells.圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡

在獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSilencer 3.1－MDR1 重組質(zhì)粒的陽性單克隆細(xì)胞后，我們檢測了HT9 細(xì)胞和單克隆細(xì)胞HT9/sh－3.1－1 對三尖杉酯堿的敏感性。結(jié)果表明，與HT9 細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)陽性單克隆細(xì)胞HT9/sh－3.1－1 的DNA ladder 更明顯，細(xì)胞染色質(zhì)DNA 裂解成180 ～200 bp 大小不等的片段;在激光共聚焦顯微鏡下，經(jīng)三尖杉酯堿處理的HT9 細(xì)胞和HT9/sh－3.1 細(xì)胞染色質(zhì)分布均勻，而HT9/sh－3.1－1 細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，出現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則的碎片狀或梅花狀等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài);另外，利用流式細(xì)胞術(shù)研究三尖杉酯堿對細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示HT9/sh－3.1－1 細(xì)胞的S 期細(xì)胞增多，并出現(xiàn)明顯的凋亡峰，HT9 和HT9/sh－3.1 細(xì)胞的細(xì)胞周期未發(fā)現(xiàn)顯著變化。綜上所述，利用RNA 干擾技術(shù)沉默MDR1 基因表達(dá)能有效增加多藥耐藥細(xì)胞HT9 對三尖杉酯堿的敏感性，增強(qiáng)三尖杉酯堿誘導(dǎo)的HT9 細(xì)胞凋亡。

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