二苯乙烯苷對LPC 損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制*

張燕堂， 張 穎， 鄭 文， 楊 華， 王家富， 商戰(zhàn)平△

(泰山醫(yī)學(xué)院1校醫(yī)院，2放射學(xué)院，4免疫學(xué)教研室，5病理生理學(xué)教研室，山東 泰安271016;3山東省交通醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)南250031)

心腦血管疾病是危害人類健康最常見的病癥之一，特別是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)疾病所導(dǎo)致的并發(fā)癥和死亡率迅速增多，目前已成為全球人口死亡的首位原因，對人體造成的危害越來越引起人們的重視。研究表明［1］，伴隨以一氧化氮(nitric oxide，NO)生物利用度降低為主而導(dǎo)致內(nèi)皮損傷被認(rèn)為是引起AS 的始動(dòng)環(huán)節(jié)。有研究表明非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)與L -精氨酸競爭性抑制NO 的合成，在調(diào)節(jié)NO 合成中具有重要作用，它通過影響NO 合成而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙［2］，研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)中藥何首烏中最主要有效的活性成分二苯乙烯苷(2，3，5，4'-tetrahydroxysilbene -2-O-β-D-glucoside，TSG)具有明顯的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用［3］，本研究旨在探討TSG 對損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑及儀器

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株、細(xì)胞凋亡試劑盒均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;胰蛋白酶和溶血磷脂酞膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)均購自Sigma;DMEM 液體培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco;ADMA試劑盒購自ID;MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(cell proliferation and cytotoxicity assay kit)、NO 試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;人血管性血友病因子(vWF)ELISA 檢測試劑盒購自北京奇松生物科技有限公司，二苯乙烯苷由中國人民解放軍泰安第88 醫(yī)院藥劑科饋贈;其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。FACSCalibur 流式細(xì)胞儀(BD);Infinite F200 多功能酶標(biāo)儀(TECAN)。

2 細(xì)胞的培養(yǎng)及其生物學(xué)特征

細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、傳代并經(jīng)人von Willebrand 因子鑒定其含量為100.02 ±2.94，將第3、4 代用于實(shí)驗(yàn)。鏡下觀察，細(xì)胞由均勻狀態(tài)變?yōu)榫o密貼壁生長，呈鋪路石狀，并可見多種細(xì)胞形態(tài)，以多角或長條形多見，胰酶消化折光性好、變圓、變亮。內(nèi)皮細(xì)胞貼壁生長、生長的密度依賴性及接觸抑制等生物學(xué)特征。細(xì)胞經(jīng)LPC損傷后可見其排列紊亂，胞體收縮變圓，細(xì)胞間隙增大，胞膜邊緣不清，部分細(xì)胞懸浮脫落。經(jīng)TSG 處理后狀況有所好轉(zhuǎn)，形態(tài)接近正常，細(xì)胞間隙縮小，連接增加，邊界變清，見圖1。

Figure 1. Cell damage and processing(×200).A:control;B:LPC;C:LPC+TSG.圖1 鏡下細(xì)胞損傷與處理

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組 10 mg/L LPC 作用于人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，孵育24 h 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，建立細(xì)胞損傷的模型(LPC 組);10.0、1.0 和0.1 μmol/L TSG 預(yù)先作用于HUVECs 1 h 后，再給予10 mg/L LPC 作用于HUVECs 共同孵育24 h，建立TSG+LPC 組;同時(shí)，設(shè)立不加藥物的空白對照組。然后，收集細(xì)胞及上清液測定指標(biāo)。以上每組隨機(jī)設(shè)不低于3 個(gè)復(fù)孔，在不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

3.2 MTT 比色法測定細(xì)胞的存活率 按照試劑盒說明書的要求操作，吸棄培養(yǎng)基，加入新培養(yǎng)基，排除藥物對MTT 的影響，每孔加入20 μL MTT 溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm 處測量各孔的吸光值(A)。細(xì)胞存活率(%)=(測定管A 值-空白管A 值)/(標(biāo)準(zhǔn)管A 值-空白管A 值)×100%。

3.3 生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme -linked immunosorbent assay，ELISA)測定細(xì)胞上清液中ADMA 含量 溫育后，加入生物素標(biāo)記的抗ADMA抗體，再與鏈霉素和-HRP 結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中ADMA 的濃度呈正相關(guān)。因此，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的A 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的A 值在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的濃度，即為樣品中ADMA 的含量。

3.4 硝酸還原酶法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO 含量

人體內(nèi)的NO 性質(zhì)活潑，代謝釋放后很快轉(zhuǎn)變成代謝產(chǎn)物NO2-和NO3-，且NO2-又進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為NO3-。血清NO3-與NO2-濃度之和(NO3-+NO2-)才能準(zhǔn)確代表體內(nèi)NO 水平。因此，收集對數(shù)期(80%～90%融合狀態(tài)的)細(xì)胞，胰酶消化，以60% ～70%融合的密度鋪板。置95%O2、5%CO2、37 ℃溫箱培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，細(xì)胞達(dá)到同步化后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建立模型組，實(shí)驗(yàn)組中加入不同濃度的藥物作用1 h后，再加入LPC 作用24 h 檢測。本測定方法是利用硝酸還原酶特異性將NO3-還原成NO2-，并按照試劑盒的操作方法進(jìn)行，通過顯色深淺，利用紫外分光光度計(jì)測定吸光度值，再計(jì)算其濃度的高低。計(jì)算公式:

3.5 Annexin V-FITC/PI 熒光雙染色法測定細(xì)胞凋亡率 在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后(細(xì)胞數(shù)量不應(yīng)低于1×105個(gè))，把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，用PBS 洗滌細(xì)胞1 次，用不含EDTA 的胰酶消化，吸除消化液，收集細(xì)胞，加入上一步驟中的培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，高速離心機(jī)離心(2 000 r/min)5 min，棄上清，收集細(xì)胞(1 ～5)×105個(gè)，用PBS 洗滌細(xì)胞，并用高速離心機(jī)離心(2 000 r/min)5 min，棄上清。每管中加入500 μL binding buffer 輕輕懸浮細(xì)胞后。每管中加入5 μL Annexin V-FITC 混勻后，室溫避光孵育10 min，再加入5 μL propidium iodide，混勻。在室溫下避光反應(yīng)5 ～10 min 后，應(yīng)在1 h 內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(激發(fā)波長Ex=488 nm，發(fā)射波長Em=530 nm)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SAS 8.1 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示進(jìn)行方差分析，各組間兩兩比較使用SNK 法，以P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT 結(jié)果

LPC(10 mg/L)損傷組HUVECs 共孵育24 h后，能顯著降低細(xì)胞的存活(P ＜0.05);TSG+LPC 組中預(yù)先使用TSG(10.0、1.0、0.1 μmol/L)作用于HUVECs 1 h，各組均能阻止LPC 所致HUVECs 損傷(P＜0.05)，而且均能升高其存活率(P ＜0.05)，見圖2。

Figure 2. Comparison of the cell survival rates in different groups. ± s. n =10. #P ＜0. 05 vs control;* P ＜0.05 vs LPC.圖2 各組細(xì)胞存活率的比較

2 生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測結(jié)果

LPC(10 mg/L)損傷組HUVECs 細(xì)胞共孵育24 h 后，能顯著升高細(xì)胞內(nèi)ADMA 水平(P ＜0.05);TSG+ LPC 組中預(yù)先使用TSG(10. 0、1. 0 和0. 1 μmol/L)作用于HUVECs 1 h，各組均能阻止LPC 所致HUVECs 培養(yǎng)上清液ADMA 含量的增加，而且均能降低其含量(P ＜0.05)，見圖3、表1。

Figure 3. Linear regression of ADMA detection.圖3 細(xì)胞上清液中ADMA 含量的直線回歸

表1 細(xì)胞上清液中ADMA 含量的比較Table 1. The content of ADMA in the supernatants of HUVECs(±s.n=9)

表1 細(xì)胞上清液中ADMA 含量的比較Table 1. The content of ADMA in the supernatants of HUVECs(±s.n=9)

#P ＜0.05 vs control;* P ＜0.05 vs LPC.

Group Concentration of ADMA(ng/L)Control 1 056.2 ±73.3 LPC(10 mg/L) 2 637.3 ±65.3#LPC+ TSG(10.0 μmol/L) 263.4 ±25.7*LPC+ TSG(1.0 μmol/L) 593.0 ±33.5*LPC+ TSG(0.1 μmol/L) 629.4 ±38.8*

3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO 的含量測定結(jié)果

LPC(10 mg/L)組HUVECs 細(xì)胞共孵育24 h后，能顯著減少細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO 的含量(P ＜0.05);與LPC(10 mg/L)組比較，TSG+LPC 組中預(yù)先使用TSG(10.0、1.0 和0.1 μmol/L)作用于HUVECs 1 h，各組均能阻止LPC 所致HUVECs 細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO 含量的減少，而且均能升高其含量(P＜0.05)，并顯示一定的濃度依賴性，見表2。

4 Annexin V－FITC/PI 熒光雙染色法測定細(xì)胞凋亡結(jié)果

LPC(10 mg/L)損傷組與HUVECs 共孵育24 h后，能顯著增加細(xì)胞的凋亡(P ＜0.05);TSG +LPC組使用TSG(10.0、1.0 和0.1 μmol/L)作用于HUVECs l h 后，均能阻止LPC 所致HUVECs 凋亡率的增加(P ＜0.05)，見圖4、表3。

表2 細(xì)胞上清液中NO 含量的比較Table 2. The content of NO in the supernatants of cultured HUVECs(±s.n=8)

表2 細(xì)胞上清液中NO 含量的比較Table 2. The content of NO in the supernatants of cultured HUVECs(±s.n=8)

#P ＜0.05 vs control;* P ＜0.05 vs LPC.

Group Concentration of NO(μmol/L)Control 69.63 ±3.64 LPC(10 mg/L) 37.85 ±3.40#LPC+ TSG(10.0 μmol/L) 58.85 ±3.69*LPC+ TSG(1.0 μmol/L) 51.76 ±3.40*LPC+ TSG(0.1 μmol/L) 45.65 ±3.13*

Figure 4. Flow cytometric detection of apoptosis(×200).圖4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果

表3 細(xì)胞凋亡率的比較Table 3. The comparison of HUVECs apoptosis(±s.n=3)

表3 細(xì)胞凋亡率的比較Table 3. The comparison of HUVECs apoptosis(±s.n=3)

#P ＜0.05 vs control group;* P ＜0.05 vs LPC group.

Group Apoptotic rate(%)Control 5.44 ±0.87 LPC(10 mg/L) 21.87 ±1.37#LPC+ TSG(10.0 μmol/L) 5.67 ±0.93*LPC+ TSG(1.0 μmol/L) 14.63 ±1.52*LPC+ TSG(0.1 μmol/L) 20.13 ±1.15*

討 論

LPC 作為氧化低密度脂蛋白(oxidized low -density lipoprotein，ox-LDL)的主要活性成分，可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，它能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞集落刺激因子、黏附分子、血管平滑肌生長因子以及單核細(xì)胞趨化蛋白-1 等多種蛋白分子表達(dá)，從而促進(jìn)單核細(xì)胞與動(dòng)脈內(nèi)膜的遷移、黏附，通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞清道夫受體攝入ox -LDL，引起血管壁泡沫細(xì)胞的堆積和脂紋的形成［4］，研究還發(fā)現(xiàn)以10 mg/L LPC 可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其細(xì)胞培養(yǎng)上清液中丙二醛顯著升高，而NO 含量顯著減少［5］。因此，LPC 常被用作研究血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的工具試劑，本實(shí)驗(yàn)與上述研究結(jié)果相一致。

ADMA 是一種內(nèi)源性NOS 抑制劑，可以競爭性抑制NOS 活性，減少NO 的生成，通過影響NO 合成而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙［2］。目前已有證據(jù)證實(shí)ADMA 是心血管疾病的新的危險(xiǎn)因子，與內(nèi)皮功能不全和動(dòng)脈粥樣硬化程度密切相關(guān)［6］。最近研究表明ADMA 與L-精氨酸競爭性抑制NO 的合成，在調(diào)節(jié)NO 合成中具有重要作用，B?ger 等［7］證實(shí)高膽固醇血癥家兔的血漿中ADMA 濃度明顯升高，而NO的含量明顯降低。趙雷等［8］研究結(jié)果證實(shí)不同劑量ADMA 對HUVECs 產(chǎn)生的NO 有明顯抑制作用，而且HUVECs 表面細(xì)胞間黏附分子-1 和血管細(xì)胞黏附分子-1 的表達(dá)水平明顯增高。同時(shí)，ADMA 可明顯降低HUVECs 的黏附性能和細(xì)胞數(shù)目，并對內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)有所改變。

在AS 病變發(fā)展過程中，內(nèi)皮功能受損，內(nèi)皮源性cNOS 表達(dá)或活性下降，內(nèi)皮源性NO 產(chǎn)生減少，而VSMCs 表達(dá)的iNOS 活性增加，產(chǎn)生大量NO 自由基，刺激細(xì)胞凋亡和膠原組織降解，促進(jìn)AS 的形成［9］。NO 是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化L-精氨酸脫胍基而產(chǎn)生的，它廣泛參與機(jī)體多種生理功能的調(diào)節(jié)，有舒張血管，抑制平滑肌細(xì)胞增殖和血小板聚集，減少白細(xì)胞黏附，減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷等作用［10］。NO 合成減少將導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，受損內(nèi)皮細(xì)胞合成NO 減少，從而形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致AS 的發(fā)生發(fā)展。有研究顯示在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展過程中，NO 是一種反映血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷的重要敏感標(biāo)志物之一，被稱為內(nèi)源性的抗動(dòng)脈粥樣硬化分子［11］。正常情況下，內(nèi)皮細(xì)胞釋放的NO 具有重要的血管保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示:TSG 明顯升高經(jīng)LPC 誘導(dǎo)后HUVECs 中NO 的量。

細(xì)胞凋亡也稱為程序性細(xì)胞死亡，是由基因控制的、細(xì)胞主動(dòng)的、受到嚴(yán)密調(diào)控的死亡過程，動(dòng)脈粥樣硬化的啟動(dòng)與細(xì)胞凋亡有著密切聯(lián)系。細(xì)胞凋亡是多種疾病產(chǎn)生的重要原因之一，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加不僅可以造成血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的損害，而且還嚴(yán)重影響了內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能，降低了血管內(nèi)皮在調(diào)控血管張力、血管通透性、凝血、血流、血栓溶解上的作用，從而誘發(fā)了血管病變的進(jìn)一步發(fā)生［4］。血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡對AS 的發(fā)生與發(fā)展具有重要意義［12］。Tzeng 等［13］的研究已經(jīng)證實(shí)了NO 能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而對AS 起保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，TSG 可以抑制LPC 刺激HUVECs ADMA 的釋放和細(xì)胞的凋亡，同時(shí)可增加NO 的含量及細(xì)胞存活的時(shí)間，可以推測TSG 通過影響內(nèi)源性NOS 抑制劑ADMA，增加NOS 活性，促進(jìn)NO 生成，減少細(xì)胞凋亡，而對AS 起保護(hù)作用。

綜上所述，TSG 對LPC 誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用是通過抑制內(nèi)源性NOS 抑制劑ADMA，而增加NOS 活性，促進(jìn)NO 的生成得以實(shí)現(xiàn)，同時(shí)，可能存在其它作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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