GDF5 基因rs224331 多態(tài)性與漢族青少年體格發(fā)育指標(biāo)關(guān)聯(lián)分析

裴 舟 李曉靜 王健民 楊 毅 高玲玲 沈水仙 支滌靜 陸 煒 陸 忠程若倩奚 立葉 蓉 趙諸慧 鄭章乾 章淼瀅 羅飛宏

生長分化因子-5(GDF5)基因由Hotten 等［1］于1994 年從人的cDNA 庫中首次克隆得到。GDF5 基因的表達主要集中于胚胎軟骨間充質(zhì)細胞聚集區(qū)、長骨發(fā)育的軟骨核以及即將形成關(guān)節(jié)的區(qū)域［2］，在胚胎發(fā)育，調(diào)節(jié)細胞分化，促進肢體發(fā)育，修復(fù)肌腱、韌帶、皮膚、神經(jīng)、骨和軟骨損傷等方面起到重要的作用［3～5］。GDF5 基因敲除的小鼠，其骨骼和關(guān)節(jié)韌帶發(fā)育受損，表現(xiàn)出四肢短縮和體重減輕的表型［6，7］。

GDF5 作為軟骨形成、骨骼發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，近年受到廣泛的關(guān)注與研究。國外多篇文獻報道了GDF5 單核苷酸多態(tài)性(SNP)與身高的相關(guān)性。然而，迄今為止尚未見中國人群GDF5 基因多態(tài)性與身高相關(guān)性的報道，鑒于以上研究背景，本研究選擇GDF5 基因rs224331 位點，分析其多態(tài)性與中國漢族青少年身高、體重和BMI 的關(guān)聯(lián)性。

1 方法

1.1 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) ①2007 年某技術(shù)學(xué)校入學(xué)新生，年齡和民族不限;②身體發(fā)育成熟，處于Tanner Ⅴ期;③排除先天發(fā)育畸形或后天器質(zhì)性畸形如骨折等;④排除甲狀腺疾病、垂體疾病、腫瘤和各種代謝性疾病。

1.2 研究現(xiàn)場 2007 年9 月20 ～22 日，以江蘇省泰州市某技術(shù)學(xué)校新生入學(xué)體檢為契機，在保證完成正常體檢項目的前提下，本研究課題組兒科內(nèi)分泌專科醫(yī)生進行身高和體重測量，并對本研究納入標(biāo)準(zhǔn)中的身體發(fā)育成熟期進行判斷，對排除標(biāo)準(zhǔn)中的疾病狀態(tài)進行排除。并于正常體檢肝功能檢測需要采血時征得體檢學(xué)生同意僅進行GDF5基因檢查。

1.3 標(biāo)本采集 ①身高測量:被測者赤腳站立，立正姿勢站在身高計的底板上，上肢自然下垂，足跟并攏，足尖分開約呈60 度角，雙眼平視前方，腳跟、骶骨部及兩肩胛骨(3點)靠緊身高計的立柱。測量者站在被測量者的一側(cè)，移動身高計的水平板至被測量者的頭頂，使其松緊度適當(dāng)，記下讀數(shù)，精確至0.1 cm。②體重測量:被測量者赤足，男生著短褲，女生著短褲、短袖衫，站在秤臺中央，測試讀數(shù)以kg 為單位，精確至0.1 kg。③抽取靜脈血2 mL，EDTA 抗凝，－20℃冰箱凍存。身高、體重和靜脈血均于體檢日上午空腹?fàn)顟B(tài)下采集。

1.4 超重和肥胖標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)2008 年WHO 推薦的成人超重及肥胖標(biāo)準(zhǔn)［8］:體重正常:18.5≤BMI ＜25，超重:25≤BMI ＜30，肥胖:BMI≥30。

1.5 基因組DNA 提取 采用TIAGEN 血液基因組DNA提取試劑盒。A260/A280為1.6 ～2.0，并將樣本濃度稀釋至15 ～20 ng·μL－1。

1.6 SNP 位點選擇 rs224331 是位于GDF5 基因外顯子區(qū)域的一個錯義突變，引起Ser276Ala 氨基酸改變。該位點與GDF5 基因內(nèi)的多個位點(如rs143383、rs143384 和rs224333 等)連鎖，r2分別為0.933、0.967 和0.967。圖1所示的LD Plot 圖顯示了該基因各個SNP 位點之間的連鎖情況，方塊顏色的差異表示連鎖程度不同，顏色越深表示連鎖程度越高。

圖1 GDF5 基因多態(tài)性位點連鎖分析Fig 1Linkage disequilibrium analysis of GDF5 gene polymorphism loci

1.7 SNP 位點分型 采用ABI 公司Taqman 探針，C__25619958_10 。反應(yīng)總體積為5 μL:包括40 ×探針0.125 μL，2 × Mix 2. 5 μL，DNA 1 μL，ddH2O 1. 375 μL。采用Roche LightCycler 480 PCR 儀進行擴增反應(yīng)，PCR 反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性10 min;92℃變性15 s，60℃延伸1 min，重復(fù)45 個循環(huán);60℃30 s，40℃1 s。rs224331 位點分型結(jié)果如圖2 所示。

圖2 rs224331 位點分型散點圖Fig 2 Endpoint fluorescence scatter plot of rs224331

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用Execl 軟件建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS15.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s 表示。身高、體重和BMI 行正態(tài)分布檢驗，不同基因型間比較正態(tài)分布采用單因素方差分析，偏態(tài)分布采用非參數(shù)秩和檢驗?；蛐图捌涞任换蝾l率分布進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗。基因頻率比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 研究人群的一般情況 應(yīng)當(dāng)參與體檢的新生共1 790名，年齡17 ～22 歲，均為漢族，青春發(fā)育均達到Tanner Ⅴ期。97.9%(1 754/1 790)SNP 分型成功，男生859 名，年齡(19.5 ±0.9)歲，身高(172.3 ±5.7)cm，體重(63.0 ±10.5)kg，BMI (21.2 ±3.3)kg·m－2，達超重標(biāo)準(zhǔn)76 名(8.8%)，達肥胖標(biāo)準(zhǔn)21 名(2.4%);女生895 名，年齡(19.2 ±0.9)歲，身高(160. 0 ± 5. 3)cm，體重(52. 2 ± 6. 9)kg，BMI(20.4 ±2.5)kg·m－2，達超重標(biāo)準(zhǔn)37 名(4.1%)，達肥胖標(biāo)準(zhǔn)2 名(0.2%)。

2. 2 連鎖不平衡檢驗 表1 顯示，rs224331 位點最常見的基因型是AA(51.7%)，其次是AC(39.6%)，CC 基因型最為少見(8.7%)。在Hardy-Weinberg 平衡檢驗中，無論是總樣本還是男生、女生，rs224331 位點的基因型和等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡。

表1 GDF5 基因rs224331 位點基因型和等位基因頻率分布［n(%)］Tab 1 Genotype and allele frequencies of the SNP (rs224331)of the GDF5 gene in Chinese adults［n(%)］

2.3 GDF5 基因rs224331 多態(tài)性與身高、體重和BMI 的相關(guān)性 ①與身高的相關(guān)性(表2):男生和女生的身高均呈正態(tài)分布，單因素方差分析結(jié)果顯示，男生和女生rs224331位點的基因型分布均與身高無相關(guān)性，P 分別為0.728 和0.723。②與體重、BMI 的相關(guān)性(表2):男生和女生的體重、BMI 均呈偏態(tài)分布，非參數(shù)秩和檢驗結(jié)果顯示，男生rs224331 位點不同基因型分布和體重、BMI 存在相關(guān)性，P分別為2.32 ×10－4和3.19 ×10－4;女生無顯著相關(guān)性，P分別為0.713 和0.921。

GDF5 基因rs224331 位點不同基因型與身高、體重和BMI 線性回歸分析顯示(表3)，AC 基因型的男生體重和BMI 均高于AA 基因型，P 均為0.002;女生則無此差異。

表2 GDF5 基因rs224331 位點不同基因型身高、體重和BMI 比較(±s)Tab 2 Relationship between rs224331 polymorphism and height，weight and BMI(±s)

表2 GDF5 基因rs224331 位點不同基因型身高、體重和BMI 比較(±s)Tab 2 Relationship between rs224331 polymorphism and height，weight and BMI(±s)

Notes The unit of height，weight and BMI was cm，kg and kg·m －2，respectively

AA AC CC P Male(n=859)0.728 Weight 61.9 ±10.4 64.3 ±10.5 64.0 ±10.3 2.32 ×10 －4 Height 172.2 ±5.6 172.5 ±6.0 172.6 ±4.9 BMI 20.9 ±3.2 21.6 ±3.3 21.5 ±3.3 3.19 ×10 －4 Femlae(n=895)0.723 Weight52.2 ±7.252.3 ±6.651.9 ±7.00.713 Height 159.9 ±5.3 160.2 ±5.3 159.9 ±5.3 0.921 BMI 20.4 ±2.5 20.4 ±2.4 20.3 ±2.5

表3 GDF5 基因rs224331 位點不同基因型對身高、體重和BMI影響的線性回歸分析Tab 3 Linear regression analysis of the relationship between rs224331 polymorphism and height，weight and BMI

3 討論

國外在GDF5 基因多態(tài)性與軟骨形成、骨骼發(fā)育和身高的相關(guān)性研究中，多選擇rs143384 和rs143383 位點，一般認(rèn)為當(dāng)兩個位點r2＞0.8，則其中一個位點可代替另一個位點［9］。圖1 為中國漢族人群的GDF5 基因多態(tài)性位點連鎖關(guān)聯(lián)，本研究中選取的rs224331 位點與rs224333，rs224330，rs143383，rs143384 位點的r2均＞0.8，說明這些位點間的連鎖性強。

本研究為了探討中國漢族人群中GDF5 基因多態(tài)性與身高的相關(guān)性，選取了引起錯義突變的一個常見位點rs224331，發(fā)現(xiàn)GDF5 基因多態(tài)性位點rs224331 不同基因型分布與身高之間無明顯的相關(guān)性，與國外多項研究結(jié)論相反。芬蘭6 114 人的GWAS 研究發(fā)現(xiàn)［10］，GDF5 基因多態(tài)性位點rs6060369 與身高相關(guān)(P =9.7 ×10－7);荷蘭鹿特丹市的人群研究發(fā)現(xiàn)［11］，GDF5 基因rs143383 多態(tài)性與女性身高存在關(guān)聯(lián)性;8 184 名歐洲裔美國兒童中驗證了之前文獻報道的與身高相關(guān)性最強的51 個位點的SNP［12］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中16 個位點在該人群中與身高相關(guān)，包括GDF5多態(tài)性位點rs4911494(P=1.63 ×10－3)。本文結(jié)果與上述文獻結(jié)論不一致的原因可能為:①種族差異:rs224331 位點的等位基因分布頻率可能在不同人種中存在差異，上述文獻報道均為歐洲人種GDF5 基因多態(tài)性與身高有相關(guān)性，本研究人群為中國漢族人。②身高是人體生長發(fā)育重要的生理參數(shù)，由多種因素共同作用［13］，雖然遺傳因素起到80%的作用，但營養(yǎng)、疾病和環(huán)境等因素的作用亦不能忽視［14，15］。③本研究人群樣本量可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。④本研究僅選取了rs224331 位點，盡管與文獻［10～12］選取的基因位點有很強的關(guān)聯(lián)性，但對更加全面的詮釋GDF5與身高的關(guān)聯(lián)性可能產(chǎn)生影響。

雖然本研究沒有得到與國際相對一致的GDF5 基因多態(tài)性與身高之間相關(guān)性的結(jié)論，但卻發(fā)現(xiàn)GDF5 基因rs224331 位點多態(tài)性與男生體重、BMI 存在相關(guān)性。與男生不同的是，本研究在女生中并未發(fā)現(xiàn)GDF5 基因多態(tài)性與體重、BMI 的相關(guān)性。分析其原因:本課題組對上海15萬兒童青少年肥胖的患病率調(diào)查發(fā)現(xiàn)，6 ～10 歲為患病率增高期，10 ～18 歲為逐漸降低期，女性的肥胖患病率顯著低于男性［16］;與西方國家的肥胖患病率隨年齡增加而升高的現(xiàn)象有著本質(zhì)的不同。本次研究與文獻［16］一致，超重和肥胖檢出率女生分別約為男生的50%和10%，因此，除遺傳因素外，中國這一年齡段的女生更注重對體型的要求可能在更大程度上影響著體重的變化。其次，GDF5 基因可能與性別相關(guān)激素有關(guān)。例如轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族的骨形成發(fā)生蛋白2(BMP2)與雌激素的作用相關(guān)，雌激素能夠促進BMP2 的表達。因GDF5 與BMP2 結(jié)構(gòu)和功能的相似性，推測其與性別相關(guān)激素可能有相關(guān)性，從而導(dǎo)致男生和女生在GDF5 基因多態(tài)性和體重、BMI 的相關(guān)性上出現(xiàn)差異［17］。

GDF5 基因rs224331 位點多態(tài)性與男生體重、BMI 相關(guān)，AC 基因型的男生體重和BMI 高于AA 基因型，AA 和CC 基因型，CC 和AC 基因型間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

總之，GDF5 基因多態(tài)性與身高、體重和BMI 的相關(guān)性結(jié)論不一。除了受研究對象種族、地域差異及其他環(huán)境因素的影響之外，不能排除其他已知的或未知的基因的協(xié)同或干擾作用。

［1］Hotten G，Neidhardt H，Jacobowsky B，et al. Cloning and expression of recombinant human growth/differentiation factor 5.Biochem Biophys Res Commun，1994，204(2):646-652

［2］Francis-West PH，Abdelfattah A，Chen P，et al. Mechanisms of GDF-5 action during skeletal development. Development，1999，126(6):1305-1315

［3］Hatakeyama Y，Tuan RS，Shum L. Distinct functions of BMP4 and GDF5 in the regulation of chondrogenesis. J Cell Biochem，2004，91(6):1204-1217

［4］Takahara M，Harada M，Guan D，et al. Developmental failure of phalanges in the absence of growth/differentiation factor 5.Bone，2004，35(5):1069-1076

［5］Oshin AO， Caporali E， Byron CR， et al. Phenotypic maintenance of articular chondrocytes in vitro requires BMP activity. Vet Comp Orthop Traumatol，2007，20(3):185-191

［6］Suto J. Identification of mutation in the growth differentiation factor 5 (Gdf5)gene in NC-brp/brp mice. J Vet Med Sci，2006，68(10):1121-1124

［7］Daans M，Luyten FP，Lories RJ. GDF5 deficiency in mice is associated with instability-driven joint damage， gait and subchondral bone changes. Ann Rheum Dis，2011，70(1):208-213

［8］http://www. who. int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/index.html

［9］Wall JD，Pritchard JK. Haplotype blocks and linkage disequilibrium in the human genome.Nat Rev Genet，2003，4(8):587-597

［10］Sanna S，Jackson AU，Nagaraja R，et al. Common variants in the GDF5-UQCC region are associated with variation in human height. Nat Genet，2008，40(2):198-203

［11］Vaes RB，Rivadeneira F，Kerkhof JM，et al. Genetic variation in the GDF5 region is associated with osteoarthritis，height，hip axis length and fracture risk:the Rotterdam study. Ann Rheum Dis，2009，68(11):1754-1760

［12］Zhao J，Li M，Bradfield JP，et al. The role of height-associated loci identified in genome wide association studies in the determination of pediatric stature. BMC Med Genet，2010，11:96

［13］Lettre G.Genetic regulation of adult stature.Curr Opin Pediatr，2009，21(4):515-522

［14］Silventoinen K，Sammalisto S，Perola M，et al. Heritability of adult body height:a comparative study of twin cohorts in eight countries. Twin Res，2003. 6(5):399-408

［15］Perola M，Sammalisto S，Hiekkalinna T，et al. Combined genome scans for body stature in 6，602 European twins:evidence for common Caucasian loci. PLoS Genet，2007，3(6):e97

［16］Zhang M，Guo F，Tu Y，et al. Further increase of obesity prevalence in Chinese children and adolescents -cross-sectional data of two consecutive samples from the city of Shanghai from 2003 to 2008. Pediatr Diabetes，2012，6;9999(9999). Epub ahead of print

［17］Zhou S，Turgeman G，Harris SE，et al. Estrogens activate bone morphogenetic protein-2 gene transcription in mouse mesenchymal stem cells. Mol Endocrinol，2003，17(1):56-66